图2。合成,表征和DBCO修饰脂质体的体外靶向效应。(a)DBCO修饰的脂质体合成DSPE-PEG 2000 -DBCO,DOPC和胆固醇的示意图。使用DSPE-PEG 2000合成未修饰的脂质体。(b)DBCO-LIPO的大小和Zeta电位。(c)DOX和R837混合物的HPLC痕迹或dox/r837的提取物的提取物。将检测波长设置为254 nm。(d)在(c)中〜6.5分钟时检测到的DBCO脂质的UV吸收光谱。(E)用AC 4 Mannaz或PBS预处理的4T1细胞的共聚焦图像48小时,然后与DID封闭的DBCO-LIPO孵育30分钟。比例尺:10μm。(f)用AC 4 Mannaz或PBS预处理的4T1细胞的平均CY5荧光强度48小时,然后与DID封闭的DBCO-LIPO(2 mg/ml)孵育30分钟。(g)用AC 4 Mannaz预处理的4T1细胞的平均CY5荧光强度,然后与不同浓度的DID封闭DBCO-LIPO孵育30分钟。所有数值数据均表示为平均值±SD(0.01 < *p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.001)。
应变促进炔烃-叠氮化物环加成 (SPAAC) 已成为生物正交结合和表面固定中不可或缺的工具。虽然许多研究都集中于增强环辛炔的反应性,但是仍然缺少一种无需任何复杂设施即可评估环辛炔-叠氮化物固定化结合效率的简便方法。在本研究中,与荧光团或生物素部分连接的二苯并环辛炔/双环壬炔 (DBCO/BCN) 的不同衍生物被图案化在超低污染聚合物刷上,这可以在不进行任何先前的封闭步骤的情况下避免非特异性蛋白质污染。聚合物刷由防污底部嵌段和叠氮化物封端的顶部嵌段组成。使用普通荧光显微镜对通过微通道悬臂点样 ( μ CS) 点样的有序阵列进行结合效率的评估。两种环辛炔均通过 μ CS 与含叠氮化物的二嵌段聚合物刷表现出可靠的结合性能,但根据蛋白质结合试验,DBCO 显示出更高的分子固定表面密度。这项工作为选择合适的环辛炔与叠氮化物偶联提供了参考,并可用于设计用于分析物检测、细胞捕获和其他生物应用的生物传感器或生物平台。
图1:纳米壳合成过程和稳定性验证的示意图。(a)通过三步固定过程在细胞膜上合成DNA纳米壳,包括:(i)A'-SSDNA启动器在糖科利克斯上的固定化; (ii)杆A(绿色)通过ssDNA杂交与A'-ssDNA结合,以及(iii)杆B(蓝色)通过H-SSDNA在杆A和H'ssDNA上的杂交在杆上的rod a和h'-ssDNA杂交的结合和交联。杆A和B的直径约为7nm,长度约为400nm。三个A-SSDNA(蓝色),14 s-ssDNA(黑色)和14 h-ssDNA(黄色)均匀分布在Rod A上。14 s-ssDNA(黑色)和14 h'-ssDNA(黄色)均匀分布在杆B上。所有ssDNA悬垂都是22对。比例尺:500 nm。(b)单个DNA棒的琼脂糖凝胶电泳,以及30分钟在37°C下孵育30分钟后杆的混合物。(c)单个DNA棒和两种类型的细胞培养基中的凝集的琼脂糖凝胶电泳研究。杆A和棒混合物。(d)通过铜免费点击化学,将DBCO标记的A'-SSDNA启动器固定在叠氮化物细胞表面糖脂上。
图 1. SPAAC 与 DBCO-PEG4-Fluor545 反应过程中形成的有机(β-D-葡萄吡喃叠氮化物)与无机(叠氮化钠)叠氮化物的三唑产物表现出不同的相对荧光强度。A) DBCO-PEG4-Fluor 545 与叠氮化物的点击化学或 SPAAC 反应产生的三唑产物取决于与 DBCO 部分反应的有机叠氮化物与无机叠氮化物的类型。这里显示了在 37°C 下 1X PBS 缓冲液(pH 7.4)中 DBCO-PEG4-Fluor 545 (200 µM) 与叠氮化钠或 β-D-葡萄吡喃叠氮化物 (400 µM) 底物发生 SPAAC 反应期间观察到的三唑部分特定吸光度 (B) 和整体产物荧光 (C) 的相对变化。有趣的是,虽然吸光度没有差异,但有机叠氮化物和无机叠氮化物的 SPAAC 反应产物的最终荧光读数明显不同。请注意,吸光度是在 309 nm 处测量的,而荧光是在 550 nm 激发和 590 nm 发射(570 nm 截止)处测量的。灰色方块和红色圆圈分别对应于在指定时间点收集的无机叠氮化物和有机叠氮化物的实验数据。线
AFM显微照片(图S1)。D H分布记录在分散在Tris-Edta(TE)缓冲液中的CMP上的Malvern-Zetasizer-Nano仪器上(5 mM Tris,1 mm EDTA,1 mm EDTA,5 mm NaCl,pH 7.3)。(d)菌株促进的叠氮化物 - 烷基环加成(SPAAC)的方案 - 铜铜的铜线自由点击反应在叠氮化物标记的CMPS和二苯并杂志环链(DBCO) - 修饰的ssDNA低聚物之间。(e)根据耗尽测定估计的平均值(SEM)标准误差的平均ssDNA数量与标称移植密度r(x)相比。(f)在90 MA处的0.5%琼脂糖凝胶上,在不同的R(x)值上对CMP和CMP-DNA偶联物进行的琼脂糖凝胶电泳移位测定,P代表装载口袋。(g)CMP-DNA的凝胶相对前(r f)相对于r(0)样品的r f,无ssDNA作为r(x)的函数。(h)CMP-DNA偶联物的体积加权粒子流体动力学大小(D H)作为R(x)的函数。面板F和G中的实线是拟合参数r f lemal = 0.42 dna/nm 2和n = 6.3和r falt = 0.48 dna/nm 2和n = 4.5的山丘方程。比例尺分别在面板(a)和(b)中为50和100 nm。
在本研究中,我们提出了一种多功能的表面工程策略,即将贻贝粘附肽模拟和生物正交点击化学相结合。本研究的主要思想源自一种新型受贻贝启发的肽模拟物,其具有可生物点击的叠氮基(即多巴胺 4-叠氮化物)。与贻贝足蛋白的粘附机制(即共价/非共价共介导的表面粘附)类似,受生物启发和可生物点击的肽模拟物多巴胺 4-叠氮化物能够与多种材料稳定结合,例如金属、无机和有机聚合物基材。除了材料通用性之外,多巴胺 4-叠氮化物的叠氮残基还能够通过第二步中的生物正交点击反应与二苄基环辛炔 (DBCO-) 修饰的生物活性配体进行特定结合。为了证明该策略适用于多样化的生物功能化,我们在不同的基底上将几种典型的生物活性分子与 DBCO 功能化进行生物正交结合,以制造满足生物医学植入物基本要求的功能表面。例如,通过分别嫁接防污聚合物、抗菌肽和 NO 生成催化剂,可以轻松将抗生物污损、抗菌和抗血栓形成特性应用于相关的生物材料表面。总体而言,这种新型表面生物工程策略已显示出对基底材料类型和预期生物功能的广泛适用性。可以想象,生物正交化学的“清洁”分子修饰和受贻贝启发的表面粘附的普遍性可以协同为各种生物医学材料提供一种多功能的表面生物工程策略。