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Roseinatronobacter sp。完整的基因组序列。菌株S2，一种从pH 12蛇形化系统中分离出的化学硫代表营养
s2是从山的Ney Springs中分离出来的Shasta，加利福尼亚州，在最小培养基板上，其中包含20 mM多硫化物和10毫米乙酸盐（6）。S2在含有20 mm硫代硫酸盐和10 mm乙酸盐的液体最小培养基中进行有氧培养。详细的媒体说明可在此处找到：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bqjgmujw。S2在室温下孵育5天，以实现由先前的生长曲线确定的近似最大浊度（6）。DNA，并使用量子荧光计（美国Thermofisher Scientific，USA）进行定量。所有测序均由单个DNA准备。纳米孔库在高智能模式（280 bp/s）下使用R10.4.4的流动池（FLO-MIN114）用天然条形码24 V14试剂盒（牛津纳米孔技术，英国牛津，英国）进行测序。用孔雀鱼V.6.4.6进行，删除了质量分数<7的读数（7）。 在Seqcenter LLC（美国匹兹堡，美国）进行了 Illumina库准备和测序。 简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。 使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。 纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。 过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。 进行了四轮抛光。 质量评估和基因组统计数据，删除了质量分数<7的读数（7）。Illumina库准备和测序。简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。进行了四轮抛光。质量评估和基因组统计数据Illumina读取的质量是用FastQC（v.0.12.1）（10）过滤的，所有读取的质量得分> Q30。简短的读数与Burrows -wheeler对准器（V.0.7.17）（11）对齐，并用Pilon（V.1.24，-fix all）（12）抛光组件。
来自Ash Yellows Group
“ Cantidatus Phytoplasma Fraxini”的Ashy1菌株起源于伊萨卡（美国纽约，美国纽约），并于白灰（Fraxinus Americana），并被转移到Catharanthus Roseus（5）。使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）制备了由感染的玫瑰花芽芽孢杆菌和叶子材料制备的测序模板。使用SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国加利福尼亚州PACBIO）的SMRTBELL PREP KIT 3.0（美国）而没有其他DNA片段化制备了用于单分子实时（SMRT）的高保真库。在Max Planck Genome-Centre（德国科隆）的续集IIE设备（PACBIO）上对片段文库进行了测序，其结合KIT 2.0（PACBIO）和续集II测序套件2.0（PACBIO）。通过使用BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）和一个数据核定的数据，通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。 使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。 实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。 通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。 随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。 在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。 未发现质粒。通过BLAST+ v2.2.2.9，MetAgenome Analyze（Megan）v.6.18.2（6.18.2（6.18.2）（6）（6）（6.6.18.2（6）的候选，分类构造分类为“ candidatus phyto plasma”属，其中11,518个读取（5834中的N 50）被分配给“念珠菌Phyto等离子体”属。 GenBank的Tus Phytoplasma”和Catharanthus Roseus（登记：2024年1月）。使用PACBIO-HIFI选项和估计的基因组大小为600 kb，将其余的读数与CANU v2.2（7）组装在一起。实现了一个连续的圆形序列，具有67.17倍的覆盖率。通过爆炸分析确认了> 10 kb的序列重叠。随后，使用Artemis V18.2.0（8）手动删除序列重叠。在Rast V2.0（9）中进行了完整染色体的注释，然后在Artemis v18.2.0（8）中进行手动策划，DNAA将DNAA设置为染色体的第一个基因。未发现质粒。使用BUSCO的151个单拷贝直系同源物（94％）的比较支持了注释的完整性（10）。在染色体组装中未考虑的读数对额外的分类套筒进行了进一步的分类，并筛选了ASHY1的肉体外DNA。默认参数用于所有软件，除非另有说明。
开发用于从遥远个体获得基因检测的生物样品的方案
Omega Bio Tek E.Z.N.A. 组织DNA KIT D3396-01 OMEGA BIO TEK MAG-BIND®血液和组织DNA HDQ 96 KIT M6399-00 OMAMGA BIO TEK E.Z.N.A. Kit CMG-196 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit A1120 Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System A2360 Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit MB1004 Promega ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System A2051 Promega Wizard HMW DNA Extraction Kit A2920 Promega ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System A5081 Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit 69504 Qiagen QIAamp Fast DNA Tissue Kit 51404 Qiagen Puregene Tissue Kit 158063 Qiagen QIAGEN Genomic-tips 20/G 10223 Qiagen MagAttract HMW DNA Kit 67563 Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit 51104 Qiagen Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (25) 13323 Sigma-Aldrich Extract-N-AMP Tissue PCR Kit XNAT2-1KT Sigma-Aldrich GenElute Blood Genomic DNA Kit NA2010-1KT Takara NucleoSpin Tissue 740952.5 Takara NucleoMag Tissue 744300.1 Takara NucleoSpin® 96 DNA RapidLyse 740110.1 Takara NucleoBond HMW DNA 740160.2 Takara NucleoMag DNA Swab 744601.1 Takara NucleoSpin® Blood 740951.5 Takara NucleoMag® Blood 200 µL 744501.1 Thermo DNA Extract All Reagents Kit 4403319 Thermo MagMax DNA Multi-Sample Kit 4413020 Thermo JetFlex Genomic DNA Purification Kit A30700 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit CS11204 Zymo Quick-DNA MiniPrep D3024 Zymo Quick-DNA Miniprep Plus D4068 Zymo Quick-DNA magbead Plus Kit D4081 Zymo Quick-DNA HMW HMW Magbead d6060Omega Bio Tek E.Z.N.A.组织DNA KIT D3396-01 OMEGA BIO TEK MAG-BIND®血液和组织DNA HDQ 96 KIT M6399-00 OMAMGA BIO TEK E.Z.N.A. Kit CMG-196 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit A1120 Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System A2360 Promega MagaZorb DNA Mini-Prep Kit MB1004 Promega ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System A2051 Promega Wizard HMW DNA Extraction Kit A2920 Promega ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System A5081 Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit 69504 Qiagen QIAamp Fast DNA Tissue Kit 51404 Qiagen Puregene Tissue Kit 158063 Qiagen QIAGEN Genomic-tips 20/G 10223 Qiagen MagAttract HMW DNA Kit 67563 Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit 51104 Qiagen Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (25) 13323 Sigma-Aldrich Extract-N-AMP Tissue PCR Kit XNAT2-1KT Sigma-Aldrich GenElute Blood Genomic DNA Kit NA2010-1KT Takara NucleoSpin Tissue 740952.5 Takara NucleoMag Tissue 744300.1 Takara NucleoSpin® 96 DNA RapidLyse 740110.1 Takara NucleoBond HMW DNA 740160.2 Takara NucleoMag DNA Swab 744601.1 Takara NucleoSpin® Blood 740951.5 Takara NucleoMag® Blood 200 µL 744501.1 Thermo DNA Extract All Reagents Kit 4403319 Thermo MagMax DNA Multi-Sample Kit 4413020 Thermo JetFlex Genomic DNA Purification Kit A30700 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo GeneJet Genomic DNA Purification Kit K0721 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo PureLink Genomic DNA Mini Kit K182001 Thermo ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit CS11204 Zymo Quick-DNA MiniPrep D3024 Zymo Quick-DNA Miniprep Plus D4068 Zymo Quick-DNA magbead Plus Kit D4081 Zymo Quick-DNA HMW HMW Magbead d6060
混合轻型态在拓扑超导体中与空腔光子搭配的
细菌“ candidatus nardonella dyophthoridicola”是一种革兰氏阴性的gam- maproteotototototabterial tocyobterial tocytobiont（图。1）。特别是，它是与象鼻虫相关的细胞内义务共同主义者（1）。通过向其宿主供应酪氨酸，细菌在表皮中起着至关重要的作用（2）。与第二个象鼻虫相关的符号不同，“ candidatus sodalis pierantonius”，它在宿主的整个生命周期中保持在功能性细菌中（3-5）。我们使用长阅读测序来研究“ Ca.nardonella dryophthoridicola”菌株nardrf，与意大利人种群相关的Rhynchophorus ferrugineus。2017年，昆虫宿主是从卡塔尼亚地区的一棵棕榈树中取样的。p在25°C，黑暗的24小时内，直到分成人。剖析了十个新出现的成年人以提取其细菌。然后按照制造商的动物组织提取说明，使用Dneasy血液和组织试剂盒（意大利Qiagen，意大利）合并细菌以进行DNA提取。在90V时通过0.8％琼脂糖凝胶电泳对DNA完整性进行了1H的验证。用纳米体100分光光度计（意大利的Thermo Fisher Scienti）和Qubit双链DNA（DSDNA）高敏化测定试剂盒测量了DNA纯度和浓度。使用R9.5流单元在奴才MK1B设备上进行了长阅读测序。使用Minknow V18.03.1进行测序48小时。读取量超过500 bp进行后续分析。重点识别为“ Ca.用于图书馆制备，使用1D连接测序试剂盒（SQK-LSK 108）原始Col使用了2.5 m g的非大量和非大小选择的总基因组DNA。然后，将最终DNA的0.5 m g加载到流动细胞上。基本调用，具有高准确性算法，质量截止值为7。所有工具均使用默认参数运行，除非另有说明。使用min-iasm（7）组装了元基因组fastq读取（主机和共生体）。nardonella dyophthoridicola”，以ncbi非冗余（NR）数据库进行鉴定。提取这些概念并用于重新填充组件。重叠群用于映射和提取“ Ca.nardonella dryophthoridicola”使用minimap2 v2.17（8）。然后使用Flye v2.8.1（9）重新组装836,116读。使用Circlator v1.5.5（10）与选项进行了循环 - Merge_Min_ID 85和 - Merge_breaklen 1000，如牛津Nanopore读取。使用公开的Illumina简短读数（SRA登录
ORS 2025 年会论文第 220 号
ssouth@uoregon.edu 披露：Sanique South (N)、Yan Carlos Pacheco (N)、Levi Wood (N)、Nicholas Hannebut (N)、Cindy Brawner (N)、Matlock Jeffries (N)、Nick Willett (N) 简介：全球有数百万人患有创伤后骨关节炎 (PTOA)，它是美国导致残疾的主要原因之一。此外，目前尚无已知的治愈方法或疾病改良疗法来阻止 PTOA 进展。细胞疗法在临床前研究中通常显示出巨大的潜力；然而，临床试验显示结果差异很大。这种差异被认为部分来自供体之间细胞效力的高度异质性以及宿主环境的多变性。了解供体人类间充质细胞 (hMSCs) 的可靠性和效力是确保 PTOA 获得一致和优化的治疗结果的关键步骤。 DNA 甲基化和去甲基化在调节 MSC 再生和免疫调节中发挥作用。然而，甲基化在 MSC 调节中的确切作用，以及基线表观遗传模式是否有助于预测关键治疗特性尚不完全清楚。为了弥补这些知识空白，本研究旨在基于基线表观遗传特征和结构结果建立供体 hMSC 治疗效力的预测模型，以研究可修改的细胞靶点，确保细胞治疗获得更好且一致的治疗结果。我们假设，与预测的治疗效果较差的 hMSC 相比，预测的治疗性 hMSC 将表现出独特的表观遗传特征。方法：体外研究：从 RoosterBio 和 Lonza 购买骨髓衍生的 hMSC。将来自 12 位供体的 hMSC 培养 24 小时（RoosterNourish TM -MSC 培养基，RoosterBio；MSCGM™ 间充质干细胞生长培养基，Lonza）。收获细胞并使用 Qiagen DNEasy 试剂盒提取 DNA。DNA 经过亚硫酸盐转化（每个样本 500ng，Zymo EZ DNA 甲基化试剂盒），然后加载到 Illumina Infinium HumanMethylation EPIC 阵列上，该阵列可以量化整个基因组中的 >850,000 个 CpG 位点，包括外显子、内含子和基因间区域。使用 R（v. 4.4.0）进行统计分析。使用 ChAMP 包（v.3.14）加载和处理原始 .IDAT 文件。首先加载原始阵列数据，并将 CpG 位点甲基化数据转换为 beta 值（0-1 甲基化值估计值表示给定 CpG 位点甲基化与未甲基化探针强度之比）。然后使用默认选项的 champ.norm 函数使用 beta 混合分位数归一化程序对 beta 值进行归一化。排除以下情况：（1）检测 P ≥0.01 的探针、针对非 CpG 位点的探针、位于性染色体上的探针，以及在CpG 探针 3' 端 5bp 范围内具有已知单核苷酸多态性的探针，其次要等位基因频率≥1％ [1] (N=158,841)。对于模型开发，使用具有自动特征选择的 glmnet 包 (v. 2.0-16) 开发了弹性网络正则化广义逻辑模型。通过 3 倍内部交叉验证调整模型，并记录性能特征。由于发现几个 CpG 位点是再生能力的完美预测因子，我们随后执行了逐步减少数据集的方法，其中，在每一轮开发之后，从数据集中删除最终模型中包含的特征并重新进行开发，总共 50 轮开发周期。所有 50 轮中的所有模型都表现完美（AUC=1.0），可能是因为样本量相对较小而过度拟合。使用在 MATLAB（Mathworks）中生成的 PLSDA 和 PLSR 模型来识别治疗性 hMSC，并使用分泌的细胞因子水平读数作为独立变量，以不同的 hMSC 供体/治疗作为二元结果变量，对来自初始体外研究的 z 分数数据进行训练。使用已建立的内侧半月板横断面 (MMT) 临床前大鼠模型，在 PTOA 的体内临床前模型中验证了预测的治疗性 hMSC（图 1A）。结果：初步研究的数据用于训练 PLSR 预测统计模型。预测模型预测前瞻性地揭示了沿 LV 轴 1 分离的大约六个供体的 hMSC，预测与治疗效果相关，从而预测治疗效果较差和治疗效果较强的供体；因此，6 个样本被指定为可能的“反应者”，6 个被指定为可能的“无反应者”（图 1B）。在甲基化分析中，我们发现在 50 轮开发周期中选定了 119 个 CpG 位点。所有位点均存在显著差异甲基化（P 值 7.5E-8 至 4.1E-4）。与无反应者相比，应答者中大约一半的 CpG 为高甲基化（n=45），其余为低甲基化（n=43）。应答者与无反应者之间平均甲基化值差异最大（Δβ 最高）的 CpG 位点包括 cg14705220（Δβ=0.25 应答者-无反应者 [应答者高甲基化]，P =4E-4）和 cg09382002（Δβ=-0.23，P =3E-4 [应答者低甲基化]），图 2。然后，我们对与这些差异甲基化位置相关的基因进行了通路分析。 119 个 CpG 定位到 88 个已知基因。这些基因在 T 细胞信号转导（IL-7 信号转导通路，P =2.27E-3）、吞噬细胞：NK 细胞相互作用（IL-15 产生，P =8.13E-3）和 B 细胞信号转导（April 介导信号转导 P =8.69E-3、B 细胞活化因子信号转导 P =9.09E-3）中的重要通路中富集。有趣的是，差异甲基化基因组位置中富集程度最高的基因网络集中在几个已知的 OA 效应物周围，包括 NFkB 复合物、组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 和机械感受器 (TRPV1) 等 (图 3)。讨论：甲基化数据结果支持了我们的假设，即预测的治疗性 hMSC 将表现出独特的表观遗传特征。我们的数据表明，基于来自 hMSC 的混合细胞 DNA 甲基化数据的模型可以很容易地区分可提供治疗益处的细胞产品和不会提供治疗益处的细胞产品。这些差异甲基化模式中涉及的基因在先前在 OA 中描述的途径中富集。意义/临床意义：DNA 甲基化分析可能有助于在膝关节 OA 关节内注射前筛选 hMSC 供体，以最大限度地提高临床益处。此外，进一步研究我们发现的驱动表观遗传差异的个体细胞亚群可能会揭示出可用于开发未来膝关节 OA 疗法的新途径。致谢：本研究得到了俄勒冈州吴仔人类表现联盟的支持。