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微同源性介导的末端连接记事
遗传信息的保真度对于细胞功能和生存力至关重要。DNA 双链断裂 (DSB) 对基因组完整性构成重大威胁，需要有效的修复机制。虽然主要的修复策略通常是准确的，但矛盾的是，也存在容易出错的途径。本综述探讨了微同源介导的末端连接 (MMEJ) 的最新进展和我们对它的理解，MMEJ 是一种在生物体中保守的内在致突变 DSB 修复途径。MMEJ 的核心是 DNA 聚合酶 theta (Pol θ ) 的活性，它是一种促进 MMEJ 致突变性的专门聚合酶。我们研究了 MMEJ 活性背后的分子复杂性，并讨论了其在有丝分裂过程中的功能，其中 Pol θ 的活性作为解决持久性 DSB 的最后一搏而出现，尤其是当同源重组受到损害时。我们探索了针对 Pol θ 在癌症治疗和基因组编辑中的有希望的治疗应用。最后，我们讨论了 MMEJ 的进化后果，强调了它在保护基因组完整性和驱动基因组多样性之间的微妙平衡。
教授亚历克西斯·科莫尔
摘要：在 2016 年碱基编辑技术发展之前，基因组编辑技术通过在目标基因组位点引入双链 DNA 断裂 (DSB) 作为基因组编辑的第一步来发挥作用。这通常使用 Cas9（一种可编程的核酸内切酶）和一段称为向导 RNA (gRNA) 的 RNA 来实现，该 RNA 编码了 Cas9 将使用简单的 Watson-Crick-Franklin 碱基配对规则结合和切割的基因组位置。DSB 的细胞处理会产生多种基因组编辑产物，包括精确编辑结果以及插入和删除 (indel) 副产物。自 1990 年代基因组编辑领域成立以来，indel 与精确产物的高频率一直是该领域的长期挑战。在这里，我将介绍我的实验室为开发具有更高效率和精度的新基因组编辑方法所做的努力。其中包括开发新的碱基编辑器（BE）工具，以及提高依赖 DSB 方法的精度的新方法。
非常快速的按需 CRISPR - NSF-PAR
CRISPR-Cas 系统为可编程基因组编辑提供了多功能工具。在这里，我们开发了一种笼状 RNA 策略，允许 Cas9 结合 DNA，但在光诱导激活之前不会切割。这种方法称为超快速 CRISPR (vfCRISPR)，可在亚微米和秒级产生双链断裂 (DSB)。同步切割改善了 DNA 修复的动力学分析，揭示了细胞在几分钟内对 Cas9 诱导的 DSB 作出反应，并且可以在 DNA 连接后保留 MRE11。DNA 损伤后 H2AX 的磷酸化以每分钟超过 100 千碱基的速度传播，最高可达 30 兆碱基。使用单细胞荧光成像，我们表征了 53BP1 修复焦点形成和溶解的多个循环，第一个循环比后续循环花费的时间更长，其持续时间受修复抑制的调节。成像引导的亚细胞 Cas9 激活进一步促进了具有单等位基因分辨率的基因组操作。 vfCRISPR 能够在空间、时间和基因组坐标上进行高分辨率的 DNA 修复研究。R
用粘蛋白复合物保护基因组
摘要：DNA双链断裂（DSB）是DNA损伤的有害形式，必须对其进行牢固地解决以确保基因组稳定性。有缺陷的修复会导致染色体丧失，点突变，杂合性丧失或染色体重排，这可能导致肿瘤发生或细胞死亡。我们通过非同源末端连接和同源指导的修复（HDR）机制成功修复DNA DSB的要求与基因组折叠和动力学有关。关于DSB，局部和全球染色质组成和动力学以及3D基因组组织的发生以及核空间内的打破定位，这影响了修复的过程。粘蛋白复合物越来越多地成为基因组的关键调节剂，影响染色质组成和动力学的影响，以及通过主动环挤出机制折叠染色体和维持姐妹染色质凝聚力的折叠染色体，至关重要的基因组组织。在这里，我们考虑这种复合物现在如何成为DNA损伤响应，影响修复途径选择和效率的关键参与者。
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具有障碍性HRR的细胞依赖于易于错误的途径，例如非同源末端连接来修复DSB，从而导致遗传像差和基因组不稳定性的积累。这样的畸变可能是DNA的部分的损失或重排，包括整个基因。这种HRR能力丧失和相关基因组不稳定性的表型称为同源重组缺乏，或HRD 4,5（图2）。
CRISPR CAS9和CAS12A同源指导维修的优化设计参数
CRISPR – CAS蛋白是用于在靶向基因组基因座上引入双链断裂（DSB）的RNA引导的核酸酶。DSB通过内源性细胞途径（例如非同源末端连接（NHEJ）和同源指导修复（HDR））修复。在修复过程中提供外源DNA模板，可以通过HDR途径有意，精确地掺入所需的突变。但是，与更快但准确的NHEJ介导的修复相比，HDR的维修率通常很慢。在这里，我们使用单链寡脱氧核苷酸（SSODN）供体模板描述了全面的设计注意事项和优化的高效HDR方法，用于包括S.P.Cas9，S.P。 cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。 针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。 这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。 工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdrCas9，S.P。cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdr
分析CRISPR介导的DNA裂解后基于NHEJ的DNA修复
摘要：使用CRISPR-CAS9核酸酶进行基因组编辑是基于DNA双重断裂（DSB）的修复。在真核细胞中，DSB通过同源指导的修复（HDR），非同源末端连接（NHEJ）或微学介导的终端连接（MMEJ）途径重新加入。其中，人们认为NHEJ途径是主导的，并且发生在整个细胞周期中。已知基于NHEJ的DSB维修是错误的；但是，很少有研究深入研究内源基因。在这里，我们通过掺入外源性DNA寡核苷酸来量化基于NHEJ的DSB修复精度（称为NHEJ精度）。通过对DSB发生后的外源性DNA和内源性靶点之间的连接序列的分析，我们确定NHEJ准确性的平均值在HEK 293T细胞中的最大值约为75％。在深入的分析中，我们发现NHEJ的精度依赖于序列，并且DSB端的近端邻近基序（PAM）的值相对较低，低于PAM远端的DSB。此外，我们观察到插入突变比与NHEJ准确性程度之间存在负相关。我们的发现将扩大对CAS9介导的基因组编辑的理解。
CRISPR-Cas12a 辅助 Amycolatopsis mediterranei 基因组编辑
Amycolatopsis mediterranei U32 是利福霉素 SV 的工业生产者，其衍生物长期以来一直是抗分枝杆菌的一线药物。为了对这种重要的工业菌株进行基因改造，过去几十年来人们付出了很多努力，我们实验室成功开发了一种基于同源重组的方法，但该方法需要使用抗生素抗性基因进行正向选择，并且不支持方便的无标记基因删除。在本研究中，我们利用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统在 A. mediterranei U32 中建立了基因组编辑系统。具体来说，土拉弗朗西斯菌亚种。 novicida Cas12a (FnCas12a) 基因首先整合到 U32 基因组中，在 CRISPR RNA (crRNA) 的指导下产生靶向特异性双链 DNA (dsDNA) 断裂 (DSB)。然后，DSB 可以通过非同源 DNA 末端连接 (NHEJ) 系统或同源定向修复 (HDR) 途径修复，分别在靶基因中产生不准确或准确的突变。除了 A. mediterranei 之外，本研究还可能为 Amycolatopsis 属其他物种中 CRISPR 辅助基因组编辑系统的开发提供启示。
利用双主键编辑对大型 DNA 序列进行可编程删除、替换、整合和反转
与疾病相关的人类遗传变异范围从单碱基对替换到兆碱基重复、缺失和重排 1-3 。可以在人类细胞中安装、纠正或补充这些致病变异的基因编辑方法有可能促进对遗传疾病的了解，也可能实现新的治疗方法 4、5。过去十年来，已经开发出几种基于 CRISPR-Cas 系统的哺乳动物细胞基因编辑方法 6，包括核酸酶 7-9 、碱基编辑器 10、11 和主要编辑器 12 ，每种方法都有可能解决一组已知的致病序列变化。CRISPR-Cas 核酸酶（如 Cas9）可用于通过创建导致不受控制的插入/缺失混合的 DSB 来破坏基因。此外，配对的 Cas9 核酸酶策略可以介导长度从约 50 到 > 100,000 个碱基对的基因组 DNA 序列的靶向删除 13 。通过提供线性供体 DNA 序列，可以通过末端连接或同源性定向修复 (HDR) 过程在单个切割位点或成对切割位点之间定向插入新的 DNA 序列 14, 15。单核酸酶和成对核酸酶编辑方法虽然用途广泛，但它们也存在相当大的缺点。DNA 供体敲入伴随着高效的 indel 副产物 16，因为在大多数细胞类型中，HDR 与末端连接过程相比通常效率低下 17, 18。使用成对核酸酶进行靶向删除会产生多种副产物 13, 19，而且缺失的精确位置受到 PAM 可用性的限制。此外，在靶位或脱靶位点的 DSB 可促进大面积缺失 20-22、染色体异常 23、24 和染色体碎裂 25。 DSB 倾向于生成不良副产物和染色体改变的复杂混合物 26 - 28，这在应用基于核酸酶的编辑来操作较大的 DNA 序列时带来了相当大的挑战，特别是在治疗环境中。
新型 CRISPR 工具在心血管研究和医学中的应用
基因组编辑技术的发展彻底改变了生物医学研究，特别是自从 CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9）技术引入以来。该系统最初是在细菌免疫反应中发现的 1，随后应用于真核生物基因组编辑 2 – 4。CRISPR/Cas9 系统的简单性使基因组编辑比传统的 DNA 编辑技术更容易获得和更容易。作为一种基因组编辑工具，该系统由两个基本成分组成：一种切割 DNA 链的内切酶 Cas9，以及一种单向导 RNA（sgRNA），其中包含用于识别目标 DNA 区域的特定序列。值得注意的是，细菌中的内源性 Cas9 系统有两种 RNA 成分（CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 crRNA）； CRISPR/Cas9 工具中的 sgRNA 是由 crRNA 和反式激活 crRNA 人工改造而成。当 Cas9 和 sgRNA 被递送到细胞中时，产生的 Cas9-sgRNA 复合物被导向目标基因组位点，在那里产生 DNA 中的双链断裂 (DSB)。然后通过内源性 DNA 修复机制修复 DSB，从而实现基因敲除或敲入 5 。