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表征 retron Efe1 逆转录酶与 ncRNA 的相互作用
逆转录子是多种多样的细菌抗噬菌体防御系统。逆转录子操纵子由逆转录酶、辅助蛋白和作为逆转录引物和模板的结构化非编码 RNA 组成。逆转录子目前正在开发成细菌、植物和哺乳动物细胞中的新基因编辑工具。Finkelstein 实验室发现的一种新逆转录子系统 Efe1 在哺乳动物细胞中的基因编辑率高于目前的逆转录子基因编辑标准 Eco1。发现 Efe1 优于 Eco1 的原因可以阐明逆转录子功能背后的分子机制。在这里，我研究了 Efe1 逆转录酶，并使用低温电子显微镜重建了其 RT-msDNA 复合物的 3.9 Å 密度图。Efe1 复合物与 Eco1 复合物非常相似，只是它是一种单体，并且其 msDNA 具有比 Eco1 更刚性的 DNA 茎环。在没有同源 ncRNA 的情况下，Efe1 逆转录酶溶解度急剧下降。 Efe1 逆转录酶也可被 Eco1 ncRNA 溶解并产生 Eco1 msDNA。Efe1 逆转录酶中催化残基的突变会消除 msDNA 的产生并降低溶解度。这些发现有助于了解逆转录酶与 ncRNA 的相互作用，从而决定正确的蛋白质折叠，并为未来单独纯化逆转录酶提供一些指导。
荧光 DNA 适体的细胞内表达
图 4 . (A) 对表达逆转录子 Eco2 (67 nt) 或 4LE-v1 至 v4 (126 nt) 的细胞中提取的 RT-DNA 进行变性 PAGE 分析。基因组编码的逆转录子 Eco1 (90 nt) 作为内部控制。标记物 M1 是 4LE- v4 的化学合成 DNA 版本。(B) 通过长度标准化荧光带强度分析确定逆转录子 Eco2 (67 nt) 和 4LE 变体相对应的 RT-DNA 相对于内源性 Eco1 的富集倍数。所示数据来自 n = 3 个技术重复。(C) 用 DFHBI-1T 进行大量体内荧光测量。配对 t 检验，诱导与未诱导：Eco2，p = 0.86；4LE-v1，p = 0.27；4LE-v2，p = 0.003；4LE-v3，p = 0.007； 4LE-v4，p = 0.005；n = 3 个生物学重复。（D）表达 4Lettuce 位置变体的 DFHBI-1T 染色细胞的流式细胞术分析。153
使用跨越生命的王国的重试改善了柔性DNA生产的体系结构
图1。对影响RT-DNA产生的反性NCRNA的修改。a。下面的Eco1 119反元操作子的示意图，以及上面的NCRNA（粉红色）转换为RT-DNA（蓝色）。b。分析120的内源性RT-DNA在BL21-AI野生型细胞（WT）中产生的内源性RT-DNA和RetroN 121操纵子（KO）的敲除。c。 RT-DNA的QPCR分析示意图。蓝色/黑色底漆对将使用122 RT-DNA和质粒的MSD部分作为模板进行扩增。红色/黑色底漆对仅使用123作为模板进行扩增。d。 QPCR仅在质粒上富集RT-DNA/质粒模板，相对于未诱导的条件，124。圆圈显示三个生物学重复中的每一个。e。 125个变体库构建和分析的示意图。f。 RT-DNA测序准备管道的示意图。g。 126每个茎长度变体的相对RT-DNA丰度占WT的百分比。圆圈代表三个127个生物学重复中的每一个。wt长度以蓝色显示，并以100％的虚线显示。h。示意图说明128 reton ncRNA的A1和A2区域。i。 A1/A2区域的变体与129 MSD环中的条形码链接用于测序。j。每个A1/A2长度变体的相对RT-DNA丰度占WT的百分比。130个圆圈代表三个生物学重复中的每一个。wt长度以蓝色显示，并以131％的虚线100％显示。补充表1中的所有统计数据。132
高通量变体库和机器学习为 Retron 基因编辑器提供设计规则
细菌逆转录酶系统在许多生物技术应用中充当单链 DNA 的细胞内工厂。在这些技术中，天然的逆转录酶非编码 RNA (ncRNA) 被修饰以编码模板，以通过逆转录产生定制 DNA 序列。逆转录效率是逆转录酶技术的主要限制步骤，但我们缺乏系统的知识，了解如何在改变逆转录酶序列以产生定制 DNA 的同时提高或保持逆转录效率。在这里，我们测试了数千种对逆转录酶-Eco1 ncRNA 的不同修饰，并在汇集变体文库实验中测量 DNA 的产生，从而确定了 ncRNA 中对修饰具有耐受性和不耐受性的区域。我们将这些新信息应用于特定应用：使用逆转录酶与 CRISPR-Cas9 RNA 引导核酸酶 (editron) 结合产生精确的基因组编辑供体。我们使用酿酒酵母中的高通量文库来额外定义编辑酶的设计规则。我们将有关 retron DNA 生成和编辑子设计规则的新知识扩展到人类基因组编辑，以实现迄今为止最高效率的 retron-Eco1 编辑子。
数据标签：public
D.报告条款D.1背景能源公司义务（ECO）是由英国政府于2013年引入的，以资助整个英国的能源效率措施。能源公司的义务是一种征税，它通过将家庭供暖成本降低义务（HHCRO）放在中型和大型能源供应商上，现在被认为是拥有15万名客户的人。这些征税所产生的资金被这些公司用于满足天然气和电力市场办公室（OFGEM）设定的碳减少目标。这些公司通过为国内能源效率改善项目提供资金来实现这些目标。除了碳的目标外，这些公司还设定了目标，以确保资金针对低收入家庭，以减少燃料贫困。该方案是通过以前的四个迭代ECO，ECO1，ECO2和ECO3。这种新的迭代ECO4将一直延伸至31/03/2026。d.2 Eco-Flex先前的ECO迭代引入了Eco-FLEX计划，该计划使私人家庭能够符合地方当局设定资格标准，从而获得了能源效率措施的资金。现在由OFGEM法规设定，涵盖所有地方当局。有四个路线可以通过这些路线来访问资金。新法规还允许其他组织在燃料贫困中转介家庭或提供声明。地方当局和供应商现在还必须收集和保留对Eco-FLEX计划的资格和合规要求的证据，这可以由OFGEM审核。房屋能效计划：基于区域的计划（Heeps：ABS）过去曾访问Eco资金，以帮助降低所有者占用者的工作成本。这仍然是可能的