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多价阳离子脂质体-DNA复合物介导的体外CRISPR/Cas9转染和基因编辑
摘要：成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关核酸酶 9 (Cas9) 基因编辑为癌症、心血管、神经和免疫疾病等遗传病因的疾病治疗提供了令人兴奋的新治疗可能性。然而，由于缺乏安全、多功能和有效的非病毒递送系统，其临床转化受到阻碍。本文我们报告了两种阳离子脂质体-DNA 系统（即脂质复合物）的制备和应用，用于 CRISPR/Cas9 基因递送。为此，使用了两种阳离子脂质（DOTAP，单价，和 MVL5，多价，+5 e 标称电荷），以及三种辅助脂质（DOPC、DOPE 和单油精 (GMO)）。我们证明，编码 Cas9 和单向导 RNA (sgRNA) 的质粒（由于其较大 (>9 kb) 通常难以转染）可以通过基于 MVL5 的脂质体成功转染到 HEK 293T 细胞中。相比之下，基于 DOTAP 的脂质体转染率非常低。基于 MVL5 的脂质体表现出逃离溶酶体的能力，这可能解释了其卓越的转染效率。在基因编辑方面，基于 MVL5 的脂质体实现了有希望的 GFP 敲除水平，在电荷比 (+/-) 为 10 时达到超过 35% 的敲除率。尽管敲除效率与 Lipofectamine 3000® 商业试剂相当，但基于 MVL5 的制剂中的非特异性基因敲除更为明显，这可能是因为这些制剂具有相当大的细胞毒性。总之，这些结果表明，多价脂质基脂质体复合物是有前途的 CRISPR/Cas9 质粒递送载体，通过进一步优化和功能化，其可能成为合适的体内递送系统。
![Vaxzevria，COVID-19 疫苗 (ChAdOx1-S [重组])](/simg/g:\will\search\icon\source\9\9d0067aa95463dbc4fb72aa749159135a3a08a44.png)
Vaxzevria，COVID-19 疫苗 (ChAdOx1-S [重组])
该药品需接受额外监控。这使得能够快速识别新的安全见解。要求医疗保健专业人员报告任何疑似不良反应。有关报告副作用的信息，请参阅第 4.8 节。1.药品名称 Vaxzevria TM 注射用混悬液 COVID-19 疫苗 (ChAdOx1-S [重组]) 2.定性和定量组成 多剂量小瓶，含有 10 剂 0.5 毫升（见第 6.5 节）。一剂（0.5 毫升）包含：编码 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的黑猩猩腺病毒（ChAdOx1-S）*（COVID-19 疫苗 (ChAdOx1-S [重组])），不少于 2.5 x 108 感染单位 (IU) * 在转基因人胚胎肾 293 (HEK) 细胞中并通过重组 DNA 技术生产。本产品含有转基因生物（GMO）。已知效果的赋形剂 每剂（0.5 毫升）约含 2 毫克乙醇。有关辅料的完整列表，请参阅第 6.1 节。3.药物形式 注射用混悬液（注射剂）。悬浮液呈无色至微褐色，清澈至微浑浊，pH 值为 6.6。4.临床特点 4.1 使用指征 Vaxzevria 适用于 18 岁及以上人群的主动免疫，以预防由 SARS-CoV-2 病毒引起的 COVID-19 疾病。疫苗应按照官方建议使用。4.2 剂量和给药方法 剂量 18 岁及以上人士 Vaxzevria 的主要疫苗接种系列包括两剂，每剂 0.5 毫升。第二剂应在第一剂接种后 4 至 12 周（28 至 84 天）内接种（见第 5.1 节）。
COVID -19疫苗安全更新 - 欧洲药品局
ace-2血管紧张素转化酶2 ADE抗体依赖性增强ADHU人腺病毒ADME吸收，分布，代谢，排泄AEX阴离子交换色谱体ARDS ARDS急性呼吸遇险障碍综合征作为活性药物分析型囊泡分析型牛belience-Alecine belecec salec-abelec coarine-azd122 coaa coaa coaa coaacoand19999999999999。 Bronchoalveolar Lavage BMI Body mass index BVH Bulk viral harvest BWP Biological Working Party ChAd63 Chimpanzee Adenovirus 63 ChAdOx1 Chimpanzee Adenovirus Ox1 ChAdOx1 MERS Chimpanzee Adenovirus Ox1 with MERS Spike antigen ChAdOx1 nCoV-19 Name of AZD1222 when initially developed by the University of Oxford Chadox2黑猩猩腺病毒OX2 CHMP药物用途的CHMP委员会CMV巨细胞病毒CNS中枢神经系统CNS COVID-19 COVID-19 Coronavirus疾病-2019 CPP关键过程参数CQAS PRIGSSER参数CQAS关键质量CT EDTA Edetate disodium ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISPOT Enzyme-Linked Immunospot EMA European Medicines Agency ERA Environmental Risk Assessment ERD enhanced respiratory disease EU European Union FFF Field flow fractionation FIH First in Human FP Finished product g Guide GalK Galactokinase GFP Green Fluorescent Protein GI Gastrointestinal GLP Good Laboratory Practice GM Geometric Mean GMP Good Manufacturing Practice HAdV Human Adenovirus HAdV5 Human adenovirus serotype 5 HBV Hepatitis B virus HCP Host cell protein HEK Human Embryonic Kidney Cells HIV Human Immunodeficiency Virus HRP Horseradish peroxidase ICH International Council for Harmonisation ICU Intensive care Unit IFN γ Interferon gamma IgG Immunoglobulin G
线粒体转移是一种新型的疾病诊断治疗方法
线粒体是细胞内的细胞器，在能量生产和代谢中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍与多种疾病有关，包括神经退行性疾病，代谢综合征和心血管疾病[1]。近年来，人们对开发新型治疗方法的兴趣越来越多，以靶向线粒体功能障碍并预防或治疗这些疾病。线粒体功能障碍是许多疾病的常见特征，包括神经脱发性疾病，代谢性疾病和癌症。这种功能障碍会导致能量代谢受损，氧化应激增加并改变钙稳态，最终导致疾病发病机理[2-4]。线粒体靶向疗法已成为通过恢复线粒体功能并减少氧化应激来治疗这些疾病的有前途策略[5]。然而，药物输送和特异性的局限性阻碍了这些疗法的成功[6]。因此，需要有效靶向线粒体功能障碍的新型治疗方法的急需。生物学和医学研究人员最近在线粒体转移现象中表现出极大的兴趣和关注。使用不同的机制，例如间隙连接通道（GJC），细胞外囊泡（EV）和隧穿纳米管（TNT），用于细胞间线粒体转运。在2004年，第一次Rustom等。在培养的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，人类胚胎肾（HEK）细胞和正常大鼠肾细胞中观察到TNT [7]。此外，Koyanagi等人后来发现了TNT。能够在新生大鼠心肌细胞和内皮祖细胞之间转移线粒体[8]。这些结构已在神经，肌肉和癌细胞以及免疫细胞中看到[9]。这两项调查可以被认为是该领域的开创性。作为治疗，第一个线粒体转移实验是在2006年进行的，表明来自骨髓基质细胞（BMSC）的线粒体可以转移到线粒体中，有效的A549肺癌细胞并恢复了有氧运动，但不能释放线粒体或mitochondna或mtdna。在这项研究中，作者研究
COVID-19 疫苗阿斯利康 - REG 174 信息...
英国卫生和社会保健部和药品与保健产品管理局已授权此药品临时供应。它没有上市许可，但此临时授权允许该药品用于 18 岁及以上人群的主动免疫，以预防 2019 年冠状病毒病 (COVID-19)。与英国的任何新药一样，该产品将受到密切监控，以便快速识别新的安全信息。要求医疗保健专业人员报告任何疑似不良反应。有关如何报告不良反应，请参阅第 4.8 节。 1. 药品名称 COVID-19 疫苗 阿斯利康，注射液 COVID-19 疫苗 (ChAdOx1-S [重组]) 2. 定性和定量组成 一剂（0.5 毫升）含： COVID-19 疫苗（ChAdOx1-S * 重组） 5 × 10 10 个病毒颗粒 (vp) * 重组、复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，编码 SARS-CoV-2 刺突 (S) 糖蛋白。在转基因人胚胎肾 (HEK) 293 细胞中产生。 本产品含有转基因生物 (GMO)。 已知作用的辅料 每剂（0.5 毫升）约含 2 毫克乙醇。有关辅料的完整列表，请参见第 6.1 节。 3. 药物形式 注射液。该溶液呈无色至微棕色、澄清至微不透明状，pH 值为 6.6。4. 临床特点 4.1 治疗指征 COVID-19 疫苗阿斯利康适用于 18 岁以上个体的主动免疫，以预防由 SARS-CoV-2 引起的 COVID-19。COVID-19 疫苗阿斯利康的使用应符合官方建议。4.2 用法用量和给药方法用法用量 18 岁及以上的个人 COVID-19 疫苗阿斯利康疫苗接种疗程包括两剂，每剂 0.5 毫升。第二剂应在第一剂后 4 至 12 周内注射（见第 5.1 节）。
控制释放杂志 - 研究
基因治疗是最有前途的医学领域之一，它有可能迅速推进癌症和遗传性疾病等疑难杂症的治疗。然而，临床转化受到多种药物输送障碍的限制，包括肾脏清除、吞噬作用、酶降解、蛋白质吸收以及细胞内化障碍。此外，成功的治疗需要持续释放药物有效载荷以维持有效的治疗水平。因此，控制和持续释放是一个重要的问题，因为核酸治疗剂的定位和动力学可以显著影响治疗效果。这是一个尚未满足的需求，它要求开发控释纳米颗粒 (NP) 技术，通过延长核酸药物有效载荷的释放来进一步提高基因治疗效果，从而实现持续、长期的基因表达或沉默。在此，我们提出了一种具有持续基因传递特性的聚合物 NP 系统，该系统可以通过自组装使用可生物降解和生物相容性的聚合物合成。 NP 递送系统由聚合物 NP 组成，聚合物 NP 充当药物库，包覆阳离子聚合物/核酸复合物，有助于增强基因有效载荷的保留和延长释放时间。使用绿色荧光蛋白 (GFP) 编码的 DNA 质粒 (pGFP) 作为报告基因，NP 表现出出色的细胞生物相容性和基因递送功效。在 8 天内显示了 pGFP 有效载荷的持续释放。表征和评估了形态、粒度、zeta 电位、pGFP 包封效率等物理化学特性和 pGFP 释放曲线、体外细胞毒性和 Hek 293 细胞中的转染功效等生物学特性。重要的是，NP 介导的 pGFP 持续释放会随着时间的推移产生增强的 GFP 表达。我们期望这种 NP 介导的基因递送系统能够安全、持续地释放各种基于核酸的治疗剂，并应用于基础生物学研究和临床转化。
老年癌症患者和Covid-19爆发
目的：应用于癌症治疗的纳米技术是纳米医学研究的一个越来越多的研究领域，具有磁性纳米粒子介导的抗癌药物输送系统，提供了最小可能的副作用。到此，使用无标记的共聚焦拉曼光谱研究了商业钴金属纳米颗粒的结构和化学性质。材料和方法：通过XRD和TEM研究了钴纳米颗粒的晶体结构和形态。用鱿鱼和PPM研究了磁性特性。共聚焦拉曼显微镜具有高空间分辨率和组成灵敏度。它是一种无标记的工具，可在细胞内追踪纳米颗粒，并研究无涂层的钴金属纳米颗粒与癌细胞之间的相互作用。通过MTT测定法评估了钴纳米颗粒对人类细胞的毒性。结果：MCF7和HCT116癌细胞和DPSC间充质干细胞的超paragnetic CO金属纳米颗粒摄取通过共聚焦拉曼显微镜研究。拉曼纳米颗粒特征还可以准确检测细胞内的纳米颗粒而无需标记。观察到钴纳米颗粒的快速吸收，然后观察到快速凋亡。通过针对人类胚胎肾脏（HEK）细胞的MTT测定法评估其低细胞毒性，使它们成为有望发展目标疗法的候选者。结论：无标签的共聚焦拉曼光谱可以准确地将CO金属纳米颗粒定位在细胞环境中。此外，在20MW的激光照射下，波长为532nm，可以使局部加热导致细胞内钴金属纳米颗粒的燃烧，从而为癌症光疗法开放新的途径。研究了无表面活性剂钴金属纳米颗粒与癌细胞之间的相互作用。癌细胞中易于的内吞作用表明，这些纳米颗粒在产生其凋亡方面具有潜力。这项初步研究证明了钴纳米材料在纳米医学中应用的可行性和相关性，例如光疗，高温或干细胞递送。关键字：拉曼光谱，钴纳米颗粒，癌细胞，干细胞，细胞摄取，凋亡，无标签工具
使用活性拉曼光谱法评估癌细胞摄取钴金属纳米颗粒
目的：应用于癌症治疗的纳米技术是纳米医学研究的一个越来越多的研究领域，具有磁性纳米粒子介导的抗癌药物输送系统，提供了最小可能的副作用。到此，使用无标记的共聚焦拉曼光谱研究了商业钴金属纳米颗粒的结构和化学性质。材料和方法：通过XRD和TEM研究了钴纳米颗粒的晶体结构和形态。用鱿鱼和PPM研究了磁性特性。共聚焦拉曼显微镜具有高空间分辨率和组成灵敏度。它是一种无标记的工具，可在细胞内追踪纳米颗粒，并研究无涂层的钴金属纳米颗粒与癌细胞之间的相互作用。通过MTT测定法评估了钴纳米颗粒对人类细胞的毒性。结果：MCF7和HCT116癌细胞和DPSC间充质干细胞的超paragnetic CO金属纳米颗粒摄取通过共聚焦拉曼显微镜研究。拉曼纳米颗粒特征还可以准确检测细胞内的纳米颗粒而无需标记。观察到钴纳米颗粒的快速吸收，然后观察到快速凋亡。通过针对人类胚胎肾脏（HEK）细胞的MTT测定法评估其低细胞毒性，使它们成为有望发展目标疗法的候选者。结论：无标签的共聚焦拉曼光谱可以准确地将CO金属纳米颗粒定位在细胞环境中。此外，在20MW的激光照射下，波长为532nm，可以使局部加热导致细胞内钴金属纳米颗粒的燃烧，从而为癌症光疗法开放新的途径。研究了无表面活性剂钴金属纳米颗粒与癌细胞之间的相互作用。癌细胞中易于的内吞作用表明，这些纳米颗粒在产生其凋亡方面具有潜力。这项初步研究证明了钴纳米材料在纳米医学中应用的可行性和相关性，例如光疗，高温或干细胞递送。关键字：拉曼光谱，钴纳米颗粒，癌细胞，干细胞，细胞摄取，凋亡，无标签工具
一个用于体外心脏电生理学的可访问平台
图1。点击编辑的概述和开发。a，单击编辑器的示意图（CE），它是由RNA程序编程的DNA nickase，DNA依赖性DNA聚合酶和ssDNA绑扎域组成的融合蛋白（例如，嗯，核酸内切酶； Huhe）与导向RNA（GRNA）配对。Click-DNA（clkDNA）模板是一种单链DNA寡核苷酸，它编码底漆结合位点（PBS），聚合酶模板（PT）和Huhe识别位点B，从709序列产生的系统生成树47序列47，描绘了Huains多样性的小型元素，该序列是47个序列。量表表示序列之间的分数相关性。c，与ssDNA分子共价磷酸酪氨酸加合物形成共价磷酸酪氨酸加合物的示意图，其中huhe结合了识别顺序以引发单点样共轭反应。d，逐步点击编辑机制，涉及：（1）DNA目标位点释放非目标链（NTS）3'基因组瓣，（2）NTS laps plap杂交与clkDNA PBS，（3）NTS-NTS-NTS-NTS-PBS连接与DNA依赖性DNA Polimentsion（4）nts-pbs intthers（3） clkDNA的编码PT，（5）新合成的3'和天然基因组5'襟翼之间的平衡，以及（6）5'-flap裂解，导致编辑结合。e，在HEK 293T细胞中的点击编辑转染的示意图，涉及CE质粒的共转染（Porcine Circovirus 2（PCV2）Huhe Huhe与NSPCAS9（H840A）融合，并从e.coli dna Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA））中， clkDNA和一个（或两个）GRNA质粒（S）。ngrna）针对非编辑链的目标编辑效率。f，g，使用DNMT1 GRNA和带有PBS13-PT12的clkDNA插入或读取突变（Indels）的 f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即
膜化学在慢病毒载体中的作用...
关键词：澄清，肺病毒载体，细胞和基因治疗（CGT），膜材料，使用许多细胞和基因疗法（CGT），利用慢病毒载体（LV）将治疗性遗传材料运送到宿主细胞的早期开发中，导致了最高的生产量的延伸和延伸的过程，从而使遗传细胞促进了量度高的遗传细胞，从而超过了kossect speatign optren的过程。 。慢病毒载体的生产被广泛细分为上游（载体的产生）和下游（旨在在稳定且无菌的配方中净化和产生浓缩的高质量功能矢量）。膜加工通常在下游步骤中使用，从澄清和无菌过滤过程中的正常流量过滤（NFF）到矢量浓度或配方期间的切向流量过滤[2]。在本演讲中，我们将通过不同材料的NFF膜来阐明原油收获。不同的膜化学表现出独特的特性，可以影响污染的速度和程度。一种结垢机制是通过吸附，当饲料中的材料通过疏水相互作用或离子电荷吸引到膜表面时，可能会发生这种情况[3]。在我们的研究中，我们使用辅助HEK 293T细胞生产了瞬时转染的VSV-G型第三代LV，并通过不同的膜化学液通过0.45 µM过滤器阐明了粗糙的收获。这强调，与尼龙的功能载体67％相比，PES恢复了93％，膜材料的选择可以改善LV恢复。然后，我们应用了新型技术，例如表面Zeta电位，以预测与表面和粗糙收获饲料的相互作用。这表明与负LV粗饲料相比，尼龙具有正表电荷，这可能会导致更高的吸附率ON和与膜表面相互作用，从而导致功能矢量颗粒的损失。最后，我们使用共共聚焦（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）可视化膜表面的结垢和LV。已经进行了进一步的研究，以了解收获饲料的变异性（例如悬浮培养物或稳定的细胞系材料）如何改变这些相互作用，并且在何种程度上可以预处理或膜制备步骤有助于减少这些损失。行业旨在朝着可以在较小且多种设施（C级或D级）中运行的封闭的一次性系统，需要仔细选择诸如过滤膜之类的材料以进行过程兼容性和最佳恢复[4]。