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利用 CRISPR–Cas9 平铺筛选对人类有丝分裂基因进行功能解析
人类蛋白质编码基因的身份众所周知，但我们对其分子功能和域结构的深入了解仍然受到基于同源性的预测和专注于全基因耗竭的实验方法的缺陷的限制。为了弥补这一知识空白，我们开发了一种方法，利用 CRISPR - Cas9 诱导的蛋白质编码基因突变来先验地识别序列水平的功能区域。作为一个测试案例，我们将这种方法应用于 48 个人类有丝分裂基因，揭示了细胞增殖所需的数百个区域，包括实验表征的区域、基于同源性预测的区域和新区域。我们验证了 15 个区域的筛选结果，包括 Mad1 的 387 - 402 个氨基酸，这些氨基酸以前未被表征，但有助于 Mad1 着丝粒定位和染色体分离保真度。总之，我们证明基于 CRISPR - Cas9 的平铺诱变可以从头识别蛋白质编码基因中的关键功能域，从而阐明功能突变体的分离并允许跨人类蛋白质组的功能注释。
PICH 通过其 DNA 转位酶和 SUMO 相互作用活动影响纺锤体组装检查点
致作者的评论（必填）：在本稿中，Lama 及其同事认为 PICH 重塑了 SUMO 化蛋白，以确保纺锤体组装检查点的正确暂时沉默。支持这一想法的主要观察结果是，PICH 的消耗，或在缺乏内源性 PICH 的细胞中重新表达缺乏 SUMO 结合能力或 ATPase 活性的外源性 PICH 突变体（分别被识别为 PICH ∆3SIM 和 K128A）在有丝分裂中（非常轻微地）延迟。作者询问这种短暂的停滞是否是由 Topo2alpha 依赖性通路的激活引起的（在之前的论文中进行了描述，并命名为 TRC，代表 Topo2alpha 响应检查点）。在得出事实并非如此的结论后，他们转向纺锤体组装检查点 (SAC)，并发现在 PICH 消耗时或在表达功能失调的 PICH 突变体的细胞中，检查点蛋白 MAD1 在动粒上的停留时间延长。由于已知 PICH 会与 SUMO 化蛋白相互作用，作者推测 PICH 的缺失或用突变体替代可能导致 SUMO 化蛋白的积累，这可能是观察到的有丝分裂延迟的原因。为了验证这个想法，作者生成了一个表达标记 SUMO2 的细胞系，并比较了在存在或不存在 PICH 功能的情况下 SUMO2 结合蛋白的丰度。这确定了几种蛋白质，当 PICH 功能受损时，它们的 SUMO 化似乎会增加。在这些蛋白质中，作者确定了 BUB1，并证明在 PICH 缺失后 BUB1 动粒水平略有增加，这种影响可能是由于检查点激活恢复缺陷造成的。作者的模型是 PICH 有助于从动粒中去除 SUMO 化蛋白以促进检查点沉默。本文介绍的工作是通过创建几个细胞系实现的，清楚地反映了作者的大量宝贵努力。这项研究的主要局限性在于，观察到的影响非常小，并且没有最终证据表明导致这些影响的 PICH 的功能是精确且完全调节性的。它可能反映出持续的小附着错误，可能是由着丝粒染色质组织中的小问题引起的，该问题会向 SAC 发出信号。也就是说，延迟可能不只是反映出沉默错误，而是持续的检查点激活，这是作者没有解决的问题，而且考虑到停滞的实体很小，这个问题很难解决。在这方面，提出的模型也将过度的 SUMO 化确定为有丝分裂延迟的原因，虽然并非难以置信，但在分析的这个阶段似乎没有得到充分支持。在没有 PICH 的情况下观察到 SUMO 化增加，但细胞能够在对照细胞之后几分钟离开有丝分裂，这意味着必须存在处理过量 SUMO 的其他蛋白质。由于作者没有排除有丝分裂延迟仅仅是由真正的 SAC 激活引起的，PICH 在控制 SUMO 化方面的作用仍不确定。因此，总的来说，我认为这项研究虽然很有价值，但尚未代表完全令人信服的概念或机制进步。其他问题 - 图 1c 和 2c 中 ∆PICH 细胞中有丝分裂时间的差异引发了一致性问题。为什么这两种情况下有丝分裂退出的时间不同？ - 在图 3 中，∆PICH 细胞中动粒处 MAD1 的持续时间远远超过 50 分钟，即远远超过这些细胞退出有丝分裂所需的时间（约 35 分钟，如图 1 所示）。这似乎相当难以置信，因为 MAD1 从动粒处的丢失总是先于有丝分裂退出。次要观点 -图 1B：最后一行，第 5 个面板，右下角部分隐藏的文本 -图 1C：如果作者指出此图中所示各种条件下有丝分裂退出的平均时间，将会很有帮助。 -在文本和相关图中指出 TopoIIalpha 带有 FLAG 标记
PICH 通过其 DNA 转位酶和 SUMO 相互作用活动影响纺锤体组装检查点
抑制或稳定有丝分裂中的 SUMO 化都会导致染色体分离缺陷，这表明蛋白质的动态有丝分裂 SUMO 化对于维持基因组的完整性至关重要。Polo 样激酶 1 - 相互作用检查点解旋酶 (PICH) 是一种有丝分裂染色质重塑酶，它通过三个 SUMO 相互作用基序 (SIM) 与 SUMO 化的染色体蛋白相互作用，以控制它们与染色体的结合。使用条件性 PICH 耗竭/PICH 替换的细胞系，我们发现有丝分裂缺陷与 PICH 对 SUMO 化染色体蛋白的功能受损有关。PICH 的重塑活性或 SIM 缺陷会延迟有丝分裂进程，这是由纺锤体组装检查点 (SAC) 激活引起的，这由着丝粒处 Mad1 焦点的持续时间延长所表明。通过对染色体 SUMO 化蛋白（其丰度受 PICH 活性控制）进行蛋白质组学分析，确定了可解释 SAC 激活表型的候选蛋白。在已确定的候选蛋白中，PICH 缺失时 Bub1 着丝粒丰度会增加。我们的研究结果证明了 PICH 和 SAC 之间的新关系，其中 PICH 直接或间接影响着丝粒上的 Bub1 关联，并影响 SAC 活性以控制有丝分裂。