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通过体内超成名的氨基酰基-TRNA合成酶的定向演变
抽象的遗传密码扩展（GCE）已通过实现非经典氨基酸（NCAA）的位点掺入到蛋白质中，已成为生物学的关键工具。GCE的中心是正交氨基酰基-TRNA合成酶（AARS）/tRNA对的开发，其中工程的AARS识别所选的NCAA并将其充电到解码空白密码子的TRNA（例如，琥珀终止密码子）。许多正交的AARS/tRNA对涵盖了广泛的NCAA，这是通过定向进化产生的，但是标准策略通过标准策略的新AARS/TRNA对的演变仍然是一个劳动密集型的过程，通常会产生AARS/TRNA对，并产生副最好的NCAA NCAA INCAA Incorpiesies。在这项研究中，我们提出了一种发展AARS的策略，该策略利用Orthorep来推动其在酵母中的连续超女。我们在8个独立的AARS进化运动中展示了我们的战略，从4个不同的AARS/tRNA父母开始，针对7个不同的NCAA。我们观察到了多种新型AARS的快速演变，能够将13个NCAA的整体范围纳入响应于琥珀色密码子的蛋白质中。一些进化的系统达到了琥珀色密码子指定的NCAA依赖性翻译的效率，可与酵母中有义务密码子指定的天然氨基酸翻译相当。此外，我们发现了一个令人惊讶的AAR，它演变为自我调节自己的表达，以更大程度地依赖NCAA进行翻译。这些发现证明了由Orthorep驱动的AARS进化平台支持GCE技术持续增长的潜力。
没有宿主基因组修饰的有效遗传代码扩展
补充非经典氨基酸（NCAA）可以产生具有新功能的蛋白质序列，但是现有的NCAA融合策略却遭受了低效率和上下文依赖性的影响。我们将密码子的用法视为先前未经认可的使用非本地密码子扩展有效遗传代码的贡献者。仅依靠具有天然核糖体的常规大肠杆菌菌株，我们开发了一种新型的基于质粒的密码子压缩策略，该策略可最大程度地降低上下文依赖性并改善四倍体密码子的NCAA掺入。我们确认该策略与所有已知的遗传密码扩展资源兼容，这使我们能够识别12个相互正交的tRNA – SYNTHENTAPES PAIRS。通过这些发现启用，我们进化并优化了五个tRNA – Synthetase Pairs，以在正交四曲板密码子处融合了NCAA的广泛曲目。最后，我们将这些资源扩展到一个体内生物合成平台，该平台可以很容易地创建> 100个新的肽大环，最多可达三个独特的NCAA。鉴于我们的方法和简化资源的一般性，我们的发现将加速多重遗传代码扩展，并能够发现化学多样的生物分子以用于研究人员定义的应用。
tRNA合成酶增强遗传代码扩展
使用正交翻译系统（OTSS）是通过在遗传密码中添加非经典氨基酸（NCAA）来产生非天然蛋白质的最有效方法。在寻求扩展底物特异性时，常规方法始于（超 - ）稳定酶，能够承受由于必要突变而导致的结构变化。然而，我们在这里从发展以应对不稳定性的酶开始，从而占据根本不同的位置，因此可能对突变表现出更大的弹性。通过工程化甲烷菌Coides Burtonii的精神病（“冷”）OTS，我们开发了常用的中嗜和热嗜热系统的替代方法。即使在非常低的NCAA浓度下，这种OT在体内效率和滥交方面都显示出显着的特性。鉴于适用的寄主生物的广泛范围，我们预计冷酷将极大地促进扩展的遗传密码从学科转变为高价值化学驱动的生物技术。
定向进化 Methanomethylophilus alvus 吡咯氨酰-tRNA 合成酶可产生高活性和高选择性变体
吡咯赖氨酸-tRNA 合成酶（PylRS）通常用于将非规范氨基酸（ncAA）位点特异性掺入蛋白质中。最近，Methanomethylophilus alvus PylRS（Ma PylRS）的活性位点经过合理设计，以扩大其底物兼容性，从而能够掺入难以结合的 ncAA。然而，尚未报道活性位点以外的可增强 Ma PylRS 酶特性的突变。我们利用噬菌体辅助非连续进化（PANCE）来进化 Ma PylRS，以有效掺入 N ε -Boc- L -赖氨酸（BocK）。定向进化产生了活性位点外的几种突变，这些突变大大提高了酶的活性。我们结合最有效的突变来生成一种新的 PylRS 变体（PylRS opt），它对几种赖氨酸和苯丙氨酸衍生物具有高活性和选择性。 PylRS opt 中的突变可用于增强先前设计的 PylRS 构建体，例如 Ma PylRS N166S，并且 PylRS opt 适用于需要双 ncAA 掺入的应用，并可显著提高这些目标蛋白的产量。
使用氨基酰基-TRNA合成酶/tRNA对的遗传代码扩展的实用方法
摘要：遗传密码扩展（GCE）可以使非典型氨基酸（NCAA）的位点选择性掺入蛋白质中。GCE已大大提高，可用于在细胞内部创建生物策略手柄，监测和控制蛋白质，研究翻译后修饰和工程新蛋白质功能。自建立我们的实验室以来，我们的研究集中在使用氨基酰基-TRNA合成酶/tRNA（AARS/tRNA）对中GCE在蛋白质和酶工程中的应用。该主题已经进行了广泛的审查，毫无疑问，GCE是工程蛋白质和酶的强大工具。因此，对于这个年轻的教师问题，我们想对我们使用的方法以及我们在实验室中考虑的挑战进行更技术性的了解。自启动实验室以来，我们已经成功地使用了针对各种GCE应用量身定制的十二个新颖的AARS/tRNA对。但是，我们承认该领域即使对于专家也会构成挑战。因此，在此，我们提供了NCAA合并中的方法论，并提供了一些实践评论，并将重点放在挑战，新兴解决方案和令人兴奋的发展上。