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使用 CRISPR/Cas9 进行 CBLB 消融可增强人类胎盘干细胞衍生 NK 细胞的细胞毒性，用于癌症免疫治疗
摘要 背景 肿瘤通常会对内源性免疫细胞（包括自然杀伤 (NK) 细胞）的监视产生抗性。离体激活和/或扩增的 NK 细胞对各种肿瘤细胞均具有细胞毒性，是过继性癌症免疫治疗的有前途的疗法。基因改造可以进一步增强 NK 效应细胞活性或活化敏化。在这里，我们评估了泛素连接酶 Casitas B 系淋巴瘤原癌基因-b (CBLB)（一种淋巴细胞活性的负调节剂）的基因缺失对胎盘 CD34 + 细胞来源的 NK (PNK) 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的影响。方法利用 CRISPR/Cas9 技术在胎盘来源的 CD34 + 造血干细胞中敲除 CBLB，然后分化为 PNK 细胞。在体外表征了细胞扩增、表型和对肿瘤细胞的细胞毒性。在 NOD-scid IL2R gamma 缺失 (NSG) 小鼠的急性髓系白血病 (HL-60) 肿瘤模型中测试了 CBLB 敲除 (KO) PNK 细胞的抗肿瘤功效。评估了 PNK 细胞的持久性、生物分布、增殖、表型和抗肿瘤活性。结果使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术实现了 94% 的 CBLB KO 功效。CBLB KO 胎盘 CD34 + 细胞分化为 PNK 细胞，细胞产量高，纯度 >90%（由 CD56 + CD3 − 细胞身份决定）。CBLB 消融不会影响细胞增殖、NK 细胞分化或 PNK 细胞的表型特征。与未修饰的 PNK 对照相比，CBLB KO PNK 细胞在体外对一系列液体和实体肿瘤细胞系表现出更高的细胞毒性。 CBLB KO PNK 细胞输注到经白消安处理的 NSG 小鼠体内后，表现出体内增殖和成熟，表现为 3 周内 CD16、杀伤性免疫球蛋白样受体和 NKG2A 表达增加。此外，与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB KO PNK 细胞在播散性 HL60-荧光素酶小鼠模型中表现出更高的抗肿瘤活性。结论与未修饰的 PNK 细胞相比，CBLB 消融增强了 PNK 细胞效应功能和增殖能力。这些数据表明，靶向 CBLB 可能通过增强 NK 细胞疗法的抗肿瘤活性提供治疗优势。
信息技术问题，2018，第2期，16–24
该过程由机组人员执行，其主要任务与解决飞行员导航任务直接相关。[2] 提供了有关飞行员导航综合体 (PNK) 开发的详细信息，而 [3] 给出了 PNK 中定量、测量工具和信息显示工具的分析。此外，无论哪种类型的飞机，其控制都是由机组人员执行的，这会导致与人为行为相关的故障。在飞行过程中，机组人员通过偏转飞机的控制旋钮、将数据输入 PNC 的子系统以及从多功能指示器、键盘指示器等接收信息来与客舱的信息控制领域进行交互。[1]。同时，与飞行员的心理生理学相关的特性会影响这种交互。许多可用的 PSC 会通知机组人员达到极端飞行状态、导航设备故障和 PNC 的整体状况，或提供飞行手册中规定的建议。在特定飞行情况下，如果出现某些外部因素和导航设备故障，机组人员将承受巨大的心理和情绪负担，并且只有有限的时间做出决定。这会导致飞机控制出现严重错误（人为因素）[4]。
信息技术问题，2018，第2期，16–24
该过程由机组人员执行，其主要任务与解决飞行员导航任务直接相关。[2] 提供了有关飞行员导航综合体 (PNK) 开发的详细信息，而 [3] 给出了 PNK 中定量、测量工具和信息显示工具的分析。此外，无论哪种类型的飞机，其控制都是由机组人员执行的，这会导致与人为行为相关的故障。在飞行过程中，机组人员通过偏转飞机的控制旋钮、将数据输入 PNC 的子系统以及从多功能指示器、键盘指示器等接收信息来与客舱的信息控制领域进行交互。[1]。同时，与飞行员的心理生理学相关的特性会影响这种交互。许多可用的 PSC 会通知机组人员达到极端飞行状态、导航设备故障和 PNC 的整体状况，或提供飞行手册中规定的建议。在特定飞行情况下，如果出现某些外部因素和导航设备故障，机组人员将承受巨大的心理和情绪负担，并且只有有限的时间做出决定。这会导致飞机控制出现严重错误（人为因素）[4]。
信息技术问题，2018，第2期，16–24
飞行员导航任务的解决方案。[2] 中提供了有关飞行员导航综合体 (PNK) 开发的详细信息，而 [3] 中给出了 PNK 中定量、测量工具和信息显示工具的分析。此外，无论飞机类型如何，它的控制都是由机组人员执行的，这会导致与人为行为相关的故障。在飞行过程中，机组人员通过偏转飞机的控制旋钮、将数据输入 PNC 的子系统以及从多功能指示器、键盘指示器等接收信息来与机舱的信息控制场进行交互。[1]。同时，与飞行员的心理生理学相关的特性会影响这种互动。许多可用的 PSC 会通知机组人员到达极端飞行状态、导航设备故障和 PNC 总体状况，或提供飞行手册中规定的建议。如果在特定飞行情况下出现某些外部因素和导航设备故障的组合，机组人员会承受强烈的心理情绪超负荷，并且做出决定的时间有限。这导致飞机控制出现严重错误（人为因素）[4]。
信息技术问题，2018，第2期，16–24
该过程由机组人员执行，其主要任务与解决飞行员导航任务直接相关。[2] 提供了有关飞行员导航综合体 (PNK) 开发的详细信息，而 [3] 给出了 PNK 中定量、测量工具和信息显示工具的分析。此外，无论哪种类型的飞机，其控制都是由机组人员执行的，这会导致与人为行为相关的故障。在飞行过程中，机组人员通过偏转飞机的控制旋钮、将数据输入 PNC 的子系统以及从多功能指示器、键盘指示器等接收信息来与客舱的信息控制领域进行交互。[1]。同时，与飞行员的心理生理学相关的特性会影响这种交互。许多可用的 PSC 会通知机组人员达到极端飞行状态、导航设备故障和 PNC 的整体状况，或提供飞行手册中规定的建议。在特定飞行情况下，如果出现某些外部因素和导航设备故障，机组人员将承受巨大的心理和情绪负担，并且只有有限的时间做出决定。这会导致飞机控制出现严重错误（人为因素）[4]。
信息技术问题，2018，第2期，16–24
该过程由机组人员执行，其主要任务与解决飞行员导航任务直接相关。[2] 提供了有关飞行员导航综合体 (PNK) 开发的详细信息，而 [3] 给出了 PNK 中定量、测量工具和信息显示工具的分析。此外，无论哪种类型的飞机，其控制都是由机组人员执行的，这会导致与人为行为相关的故障。在飞行过程中，机组人员通过偏转飞机的控制旋钮、将数据输入 PNC 的子系统以及从多功能指示器、键盘指示器等接收信息来与客舱的信息控制领域进行交互。[1]。同时，与飞行员的心理生理学相关的特性会影响这种交互。许多可用的 PSC 会通知机组人员达到极端飞行状态、导航设备故障和 PNC 的整体状况，或提供飞行手册中规定的建议。在特定飞行情况下，如果出现某些外部因素和导航设备故障，机组人员将承受巨大的心理和情绪负担，并且只有有限的时间做出决定。这会导致飞机控制出现严重错误（人为因素）[4]。
TDRD3-NULL小鼠显示与神经发生和突触可塑性相关的转录后和行为障碍
在37°C，200 rpm时10分钟。RNA，并在冰上被5 µL冰冷1 N NaOH碎片碎片10分钟。用25 µl 1 M Tris-HCl（pH 6.8）中和后，将RNA再次用异丙醇沉淀。Biotin RNA被预洗的dynabeads™M-280链霉亲和蛋白珠（Invitrogen，＃11206D）富含，被高盐缓冲液，分别降水缓冲液，低盐缓冲液洗涤，然后用Trizol和Zymo rna Clean＆Compentor（Zymoresearch（Zymoresearch）（Zymoresearch）在珠子上提取。用20°C的100 µM VRA3 RNA适配器与1 µL的100 µM VRA 3 RNA连接过夜。然后将生物素RNA富集并再次提取。RNA通过RPPH（NEB，＃M0356）在5'端修饰，并通过T4 PNK（NEB，＃M0201L）进行了羟基修复。被Zymo RNA清洁和浓缩器提取后