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提高 HR 频率以实现植物的精确基因组编辑
基因编辑工具，例如锌指、TALEN 和 CRISPR-Cas，为整个生命之树的植物遗传改良开辟了新领域。在真核生物中，基因组编辑主要通过两种 DNA 修复途径进行：非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 (HR)。NHEJ 是高等植物的主要机制，但它不可预测，并且经常导致不良突变、移码插入和缺失。通过 HR 进行的同源定向修复 (HDR) 通常是遗传工程师首选的编辑方法。HR 介导的基因编辑可以通过整合供体模板提供的序列来实现无错误编辑。然而，植物中天然 HR 的频率低是实现高效植物基因组工程的障碍。本综述总结了为增加植物细胞中 HDR 频率而实施的各种策略。这些策略包括针对双链 DNA 断裂的方法、优化供体序列、改变植物 DNA 修复机制以及影响植物 HR 频率的环境因素。通过使用和进一步完善这些方法，基于 HR 的基因编辑可能有一天会在植物中变得很常见，就像在其他系统中一样。
在人类细胞中进行碱基编辑以产生单核苷酸变体克隆细胞系
碱基编辑技术能够在哺乳动物细胞的目标基因组位点引入点突变，其效率和精度高于采用 DNA 双链断裂的传统基因组编辑方法，例如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR-Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 9）系统。这可以更省时省资源地生成单核苷酸变异同源细胞系（即基因组序列仅在单个编辑核苷酸处彼此不同的细胞系）。这些单核苷酸变异克隆细胞系是评估遗传变异在天然细胞环境中的功能作用的有力工具。因此，碱基编辑可以在受控实验室环境中促进基因型到表型的研究，可用于基础研究和临床应用。在这里，我们提供优化的协议（包括实验设计、方法和分析）来设计碱基编辑构建体、转染粘附细胞、批量量化碱基编辑效率以及生成单核苷酸变体克隆细胞系。
基因组学和人类遗传学年度回顾 基因组编辑技术的技术转移模型
基因组编辑的许多基本发明，包括巨核酸酶、锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR，都是首先在大学中制造并获得专利以鼓励商业开发。这导致了技术转让模式的多样性，但也带来了冲突。在大学专利的更广泛的历史和政策背景以及有关研究工具的特殊挑战的背景下，我们回顾了基因组编辑的专利财产以及用于将其商业化的多种技术转让模式，包括公共领域存储、开放获取合同、材料转让协议、非排他性和排他性许可、代理许可和聚合许可。这种多样性具有优势，它允许进行实验和竞争，我们将其描述为技术转让的联邦主义模式。基因组编辑的一个显着特点是第三方许可中介机构的兴起和成功。与此同时，基因组编辑技术的快速发展可能会削弱专利权和许可制度的重要性，并可能减轻过于宽泛的专利的影响，从而产生新的替代品来实现商业化。
基础编辑：进步和治疗机会
作为我们对基因组DNA的主要序列影响人类健康的理解，基因组编辑的治疗潜力已经出现。这场关于我们如何看待人类健康和疾病的革命在很大程度上是由基因组测序技术的快速进步所驱动的，这些技术揭示了遗传疾病的病因突变。此外，我们越来越接近精确医学的实现：基于患者的个体特征（例如其基因组序列）的预防和治疗策略的发展。因此，对于这些领域的研究人员来说，这是一个令人兴奋的时刻，因为我们应对利用基因组编辑来治疗和治愈遗传疾病的一些最知名的障碍。大约一半已知的致病遗传变异是由于单核苷酸变体（SNV）引起的，这突出了需要开发具有高效率1的方法和工具的方法1。超过96％的人遗传变异是SNV，目前99％以上缺乏临床解释2。因此，引入SNV的工具也将证明是必不可少的，即提高我们对人类遗传变异如何影响健康3 - 7的理解。要用作治疗性，基因组编辑工具必须表现出较高的靶向效率和最小的有害或不需要的脱靶编辑，并且可传递到感兴趣的器官。重要的是要注意，疾病靶标将决定必须满足这些标准的确切程度。在现场的早期努力使用了诸如锌指核酸酶和类似转录激活剂样效应子核酸酶（TALENS）的平台，但是这些方法因设计和验证新的锌指核酸酶或塔伦蛋白的需求而受到阻碍。但是，这些广泛的蛋白质重新设计要求被发现，机械阐明
体内造血干细胞基因组编辑
摘要：过去二十年，基因组编辑工具取得了巨大进步，为先天性和后天性疾病的基因治疗提供了创新而有效的方法。锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR-Cas9 已通过体外造血干细胞 (HSC) 基因治疗应用于遗传疾病（即血红蛋白病、范康尼贫血和遗传性免疫缺陷）以及传染病（即 HIV），而最近开发的基于 CRISPR-Cas9 的系统使用碱基编辑器和主要编辑器以及表观基因组编辑器为基因治疗提供了更安全的工具。然而，体外添加或编辑 HSC 基因的方法复杂、具有侵入性、技术难度大、成本高且有毒性。体内基因添加或编辑有望将基因治疗从一种高度复杂的策略转变为一种“用户友好型”方法，最终成为一种广泛可用、高度可及且可能负担得起的治疗方式。在本篇综述文章中，我们基于 30 多年来体外 HSC 基因治疗的经验教训，讨论了体内 HSC 基因编辑的概念、工具、取得的进展以及临床转化面临的挑战。
为 CRISPR/Cas9 设计引导 RNA 构建体...
水稻 (Oryza sativa L.) 是世界人口（亚洲和非洲）消费最广泛的主食。作为半水生一年生植物，水稻极易因各种环境压力而损失。许多研究表明需要开发耐非生物和生物胁迫的品种 [1] 。标记辅助育种、诱变育种、RNA 干扰、反义技术、ZFN 和 TALEN 等方法被用于开发水稻等作物抗非生物胁迫的优良性状。然而，最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶 (CRISPR/Cas) 系统作为开发作物可遗传基因操作的有效工具而备受关注 [2] 。 2013 年，利用 CRISPR/Cas9 在模式植物拟南芥中成功开发出基于基因组的编辑技术 [3] ，此后，各种作物中已成功编辑了大量与农艺性状相关的基因。这一进步为研究人员开辟了许多新的可能性，包括能够更快地了解生物植物系统。CRISPR 系统主要用于提高不同作物的产量效率、生物强化、生物和非生物胁迫耐受性 [1] 。
马铃薯的 CRISPR/Cas 基因组编辑
马铃薯 ( Solanum tuberosum L.) (2 n = 4 x = 48) 是人类消费量继大米和小麦之后的第三大重要粮食作物。马铃薯被视为欧洲和美洲部分地区的主食。2018 年，世界马铃薯总产量为 3.6817 亿吨，其中中国（9026 万吨）位居第一，印度（4853 万吨）紧随其后（FAOSTAT，2018 年）。世界人口将从现在的 77 亿增加到预计 2050 年的 97 亿，对粮食供应构成了巨大挑战（联合国，2019 年）。马铃薯易受到各种病原体、害虫和环境非生物胁迫的侵害。在气候变化情景下，情况正在恶化。在印度，主要马铃薯种植邦的平均马铃薯产量（占全国马铃薯产量的 90%）可能会在 2050 年代下降 2.0%，在 2080 年代下降 6.4%（Rana 等人，2020 年）。为了解决这些问题，常规育种在品种开发计划中发挥了关键作用，同时结合标记辅助选择，主要针对晚疫病、病毒和马铃薯胞囊线虫 - 世界各地的抗性品种，例如印度的 Kufri Karan（ICAR-CPRI 年度报告，2018-19 年）。后来，马铃薯转基因技术也得到了开发，以抵抗疾病（如晚疫病和病毒）、非生物胁迫（如高温和干旱）、害虫（如马铃薯胞囊线虫和马铃薯块茎蛾）、加工品质（如降低冷诱导甜度），但它们均未在田间应用。因此，随着测序技术的进步和马铃薯基因组序列的可用性（马铃薯基因组测序联盟，2011），有可能应用基因组学工具（如基因组编辑）来调节目标基因。基因组编辑是一种先进的基因组学工具，可通过基因敲除和插入/缺失诱变来改良作物（Hameed 等人，2018）。它允许在基因组中的特定位点发生双链断裂（DSB），并通过自然发生的 DNA 修复机制进行修复，即非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HR)。过去，该系统早期由蛋白质引导的核酸酶促进，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)。但现在，人们的注意力转向了一种新的 RNA 引导核酸酶，称为成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) — CRISPR 相关 (Cas) (Nadakuduti 等人，2018)。与组装 CRISPR/Cas 相比，TALEN 和 ZFN 需要特殊的专业知识、更长的时间和更高的成本。事实上，据报道，CRISPR/Cas 在作物中的应用取得了巨大进展。在马铃薯中，CRISPR/Cas 已被证明可以改善块茎品质、抗病性（晚疫病和马铃薯 Y 病毒）、表型和其他性状（Dangol 等人，2019 年；Hameed 等人，2020 年；Hofvander 等人，2021 年）。本文介绍了 CRISPR/Cas 的现状、未来前景以及马铃薯面临的挑战。
作物改良方法及加强粮食安全的应用
尽管大量生物（害虫、病原体）和非生物（干旱、寒冷）压力源影响着全球粮食需求，但自文明诞生之日起，农业就支撑着人类的生活。在过去 50 年中，对植物细胞和分子机制的了解不断加深，推动了生物技术的新创新，从而通过植物基因工程引入了所需的基因/特性。锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 等靶向基因组编辑技术已成为改良作物的有力工具。事实证明，这种新的 CRISPR 技术是一种高效、直接且成本低廉的过程。它适用于大多数植物物种，靶向多个基因，并被用于设计植物代谢途径以产生对病原体和非生物压力源的抵抗力。这些新型基因组编辑 (GE) 技术有望实现联合国“零饥饿”和“良好的人类健康和福祉”的可持续发展目标。这些技术可以更有效地开发转基因作物，并有助于加快美国农业部 (USDA)、食品药品监督管理局 (FDA) 和环境保护署 (EPA) 进行的监管审批和风险评估。
CRISPR-Cas9 技术用于创建能够建模和治疗病理的生物化身：从发现到最新改进
摘要：这是遗传学在基因组编辑领域取得的辉煌发展，基因组编辑包括对不同物种内细胞 DNA 序列的精确改变。目前最令人着迷的基因组编辑技术之一是成簇的规则间隔回文重复序列 (CRISPR) 及其相关蛋白 9 (CRISPR-Cas9)，由于其有效性，它们在短时间内深入融入了研究领域。它成为广泛生物和治疗应用中使用的标准工具。此外，需要可靠的疾病模型来提高医疗保健质量。CRISPR-Cas9 有可能通过生成细胞模型来丰富我们在遗传学方面的知识，这些模型可以模拟各种人类疾病，以更好地了解疾病后果并开发新的治疗方法。CRISPR-Cas9 提供的基因组编辑精确度正在为基因治疗在临床试验中的扩展铺平道路，以治疗多种物种的多种遗传疾病。本综述文章将讨论基因组编辑工具：CRISPR-Cas9、锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)。它还将涵盖 CRISPR-Cas9 技术在生成用于新型疗法的细胞疾病模型方面的重要性、其在基因治疗中的应用以及增强其特异性的新策略所面临的挑战。
理解基因编辑平台的演变，以改善作物特质
crispr（群集定期间隔短的短质体重复序列）/CAS（CASPR相关）系统最初是作为一种基本机制，用于赋予对病毒的细菌和古细菌的适应性免疫。在过去的十年中，这已被重新用于基因组编辑工具。已经开发了涉及CRISPR/CAS平台的许多基于基因编辑的作物改进技术，或与下一代测序方法结合使用，已开发出彻底改变植物基因组编辑方法的方法。最初，CRISPR/CAS核酸酶取代了早期使用的序列特异性核酸酶（SSN），例如锌 - 纤维核核酸酶（ZFN）和转录激活剂样效应子核酸酶（Talens），以解决相关离子靶标的问题。该平台的改编导致了概念的发展，例如表观基因组编辑，基础编辑和主要编辑。表观基因组编辑采用了表观效应来操纵染色质结构，而基础编辑则使用基本编辑器来设计精确的变化以改善性状。诸如Prime编辑之类的新技术现已开发为一种“搜索和重复位置”工具，用于设计所有可能的单基础更改。由于这些可用性，基因组编辑领域已迅速发展，以发展具有改善性状的作物植物。在这篇综述中，我们介绍了CRISPR/CAS系统在各种植物物种中的基因组工程方法中的发展，以及它们对调整植物基因组和相关结果对作物改善计划的影响。