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一种由内源性 Lcn9 启动子驱动的附睾起始节段特异性表达 Cre 重组酶的新型小鼠系
从睾丸释放的精子经历成熟过程并通过附睾运输获得使卵子受精的能力。附睾分为四个区域，每个区域都有独特的形态、基因谱、腔内微环境和截然不同的功能。为了研究附睾起始节（IS）中相关基因的功能，通过 CRISPR/Cas9 技术建立了一种新的 IS 特异性小鼠模型——Lcn9-Cre 敲入（KI）小鼠系。TAG 终止密码子被 2A-NLS-Cre 盒替换，导致 Lcn9 和 Cre 重组酶共表达。从出生后第 17 天首次观察到 IS 特异性 Cre 表达。使用 Rosa26 tdTomato 报告小鼠，Cre 介导的 DNA 重组仅在主细胞中检测到。使用 Lcn9-Cre 小鼠与携带 Tsc1 floxed 等位基因 (Tsc1 flox/+) 的小鼠品系杂交，进一步证实了附睾 IS 特异性 Cre 体内活性。Cre 表达不影响正常发育或雄性生育力。与之前报道的任何附睾特异性 Cre 小鼠不同，新型 Lcn9-Cre 小鼠品系可用于引入整个 IS 特异性条件基因编辑以进行基因功能研究。
2022; 18(2): 652-660. doi: 10.7150/ijbs.64188 研究论文 使用 AAV-BR1-CRISPR 对出生后小鼠脑内皮细胞进行基因组编辑
脑内皮细胞 (EC) 是血脑屏障 (BBB) 的重要组成部分，在限制可能的毒性成分和病原体进入脑部方面发挥着关键作用。然而，识别调节 BBB 稳态的内皮细胞基因仍然是一个耗时的过程。尽管体细胞基因组编辑已成为发现调节组织稳态的必需基因的有力工具，但它在脑内皮细胞中的应用尚未在体内得到证实。在这里，我们使用靶向脑内皮的腺相关病毒 (AAV-BR1) 结合 CRISPR/Cas9 系统 (AAV-BR1-CRISPR) 来特异性地敲除成年小鼠脑内皮细胞中感兴趣的基因。我们首先生成了在内皮细胞中表达 Cas9 的小鼠模型 ( Tie2 Cas9 )。我们选择了对维持成人 BBB 完整性至关重要的内皮细胞 β -catenin ( Ctnnb1 ) 基因作为靶基因。在 4 周龄 Tie2 Cas9 转基因小鼠中静脉注射 AAV-BR1-sg Ctnnb1 -tdTomato 后，导致 36.1% 的 Ctnnb1 等位基因发生突变，从而导致脑 EC 中 CTNNB1 水平急剧下降。因此，脑 EC 中的 Ctnnb1 基因编辑导致 BBB 崩溃。总之，这些结果表明 AAV-BR1-CRISPR 系统是一种有用的工具，可用于快速识别体内调节 BBB 完整性的内皮基因。
乙酰胆碱神经元在发育中的小鼠脑的三个时间窗口中变为胆碱能
中枢神经系统中乙酰胆碱（ACH）神经元在较高的大脑功能（例如注意力，学习和记忆以及运动）过程中需要协调神经网络活动。在许多神经推测和神经退行性疾病中都描述了受干扰的胆碱能信号传导。此外，其他信号分子（例如谷氨酸和GABA）与ACH的共透析与脑功能或疾病中的基本作用有关。但是，在发育过程中ACH神经元变得胆碱能何时尚不清楚。因此，了解胆碱能系统如何发展和活跃的时间表是理解大脑发育的关键部分。为了研究这一点，我们使用转基因小鼠将ACH神经元与TDTomato有选择性标记。我们在产前和产后发育期间在不同时间点成像了串行切片的大脑，并产生了全脑重建。我们发现了三个关键的时窗 - 在产前两个，一个在产后大脑中 - 大多数ACH神经元种群在大脑中胆碱能。我们还发现，胆碱能基因表达是在皮质ACH室中启动的，而大脑皮质由基础前脑的胆碱能投射神经元支配。综上所述，我们表明ACH神经元种群存在并在产后第12天之前变为Cho-Linergic，这是主要感觉过程的开始，例如听力和视力。我们得出的结论是，ACH神经元的诞生和胆碱能基因的启动在发育过程中是时间分离的，但由大脑解剖结构高度协调。
干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活