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TrueDesign 基因组编辑器
对于使用 CRISPR 技术的敲除富集实验，设计步骤中选择的 gRNA 和 Invitrogen™ TrueTag™ 供体引物将自动包含在内。该工具还将添加 TrueTag Knockout Enrichment Donor DNA Kit，其中包含所需的供体模板、PCR 试剂和清理试剂盒，以生成可用于转染的供体 DNA。还包括 Invitrogen™ TrueTag™ 验证引物，用于进行连接分析，以确保供体模板正确插入。
一种快速对基因进行 GFP 标记并富集编辑细胞的方法
图 1. 供体 DNA 模板设计。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供用于 (A) N 端标记或 (B) C 端标记目标基因的 PCR 模板。具有短同源臂 (HA) 序列的位点特异性引物用于 PCR 扩增以生成供体 DNA 分子。通过 CRISPR-Cas9 或 TALEN ™ 系统切割目标位点后，供体 DNA 在 HDR 过程中整合到基因组中。2A 自切割肽 (2A) 允许选择标记 (嘌呤霉素或杀稻瘟素) 和标记基因从内源启动子表达。每个模板的通用引发序列 (Uni) 允许轻松设计 PCR 引物。
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为了访问这些优化的基因组编辑方法，我们创建了Invitrogen™Truedesign™基因组编辑器，这是一种免费的在线工具，用于设计和订购基于CRISPR-Cas9的编辑。本申请说明描述了两种用例：（1）引入诱导多能干细胞（IPSC）（IPSC）和（2）用GFP标记β-肌动蛋白的LRRK2基因（G2019S）中的SNP变化。对于SNP变化，通过在线工具自动生成了单链寡核苷核苷酸（SSODN）供体的建议设计。对于融合蛋白，使用Invitrogen™TRUETAG™供体DNA试剂盒自动生成底漆建议，以自动生成双链供体DNA。供体DNA。此应用程序说明还描述了此转染过程的详细协议。一旦输送到细胞中，供体DNA将在不到一天的时间内将其集成到目标细胞的基因组中。