图3:整个GC富含区域的读取覆盖范围的比较:与Truseq DNA无PCR和Truseq DNA Nano库Prep Kit相比,Illumina DNA PCR无是人类RNPEPL1基因
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使用Ampure XP珠和Magflo ngs珠的方法在整个Illumina Truseq RNA库制备工作流程(图1)中处理RNA样品(图1),然后在Illumina Novaseq(2 x 100 bp)上进行测序。随后,使用FASTQC工具进行了测序质量评估。使用火山图(图4)可视化差异基因表达分析,该图描绘了显着性与倍数变化值,从而可以鉴定2个条件之间基因表达的统计学意义变化。此外,代表前30个上调基因和下调基因的热图通过不同的基于珠子的纯化方法对整体表达模式提供了见解(图5)。通过Microsynth进行了实验程序和随后的生物信息学分析。
方法,将来自摩洛哥栽培树的单叶用于本研究。DNA提取。根据制造商的说明,使用Illumina Truseq套件构建了配对的测序库。该库是在配对端,2×150bp格式的Illumina Hi-Seq平台上进行排序的。用三件v0.33(Bolger,Lohse和Usadel 2014)修剪了所得FASTQ文件的适配器/引物序列和低质量区域。修剪序列由黑桃v2.5组装(Bankevich等人2012)随后使用Zanfona V1.0(Kieras 2021)进行完成步骤,以基于相关物种中保守的区域加入附加的重叠群。
使用一个野外收集的标本进行测序。DNA提取。根据制造商的说明,使用Illumina Truseq套件构建了配对的测序库。该库是在配对端,2×150 bp格式的Illumina Hi-Seq平台上进行测序的。用三型V0.33(Bolger,Lohse和Usadel 2014)修剪了所得FASTQ文件的适配器/引物序列和低质量区域。修剪序列由黑桃v2.5组装(Bankevich,Nurk,Antipov等2012)随后使用Zanfona V1.0(Kieras 2021)进行完成步骤,以基于相关物种中保守的区域加入附加的重叠群。
单分子实时 (SMRT) DNA 测序技术 (Pacific Biosciences) 生成的长读段是高质量叶绿体 (1, 2) 和线粒体基因组序列组装的起点之一。栽培的葡萄树 Vitis vinifera 极易受到病原体的感染。抗性品种如种间杂交品种‘Börner’ (V. riparia GM183 [母株] V. cinerea Arnold [花粉供体]) 被用作培育优良葡萄品种的砧木。我们从 SMRT 读段中组装并注释了‘Börner’的叶绿体 (cp_Boe) 和线粒体 (mt_Boe) 基因组序列。除非另有说明,所有生物信息学工具均采用默认参数。从品种“Börner”的幼叶中提取基因组 DNA(3),并在 Sequel I 测序仪(1Mv3 SMRT 细胞、结合试剂盒 v3.0、测序化学 v3.0,均来自 PacBio)上进行测序。通过 BLASTN(BLAST 2.7.1)搜索(4)筛选质体或线粒体序列(RefSeq 版本 91),筛选出潜在的质体或线粒体读段。使用的标准如下:读段长度,500 个核苷酸(nt)以上;同一性,70% 以上;查询覆盖率,30% 以上。 292,574 个潜在质体读段(共 2,715,983,671 nt;N50,12,829 nt)和 426,918 个潜在线粒体读段(3,928,350,102 nt;N50,12,624 nt)分别用 Canu v1.7(5)进行组装。每个最长的重叠群都与 V. vinifera 的叶绿体(6)或线粒体(7)基因组序列具有高度相似性。随后,使用 Bandage(8)确认组装正确。手动修剪环状基因组中重叠的末端序列,并将起始序列与葡萄参考序列比对。用 Arrow(SMRT Link 版本 5.1.0.26412)对组装体进行三次完善。最后一轮精炼将起始点移至序列的相反位置。为了帮助注释,根据制造商的说明,使用 peqGOLD 植物 RNA 试剂盒 (Peqlab) 从“Börner”组织中提取 RNA。根据 TruSeq RNA 样品制备 v2 指南,从 1,000 ng 总 RNA 制备索引 Illumina 测序文库。将得到的转录组测序 (RNA-Seq) 文库以等摩尔量汇集,并在 HiSeq 1500 仪器上以 2 100-nt 双端格式进行测序。cp_Boe (161,008 bp;GC 含量,37.4%) 和 mt_Boe (755,068 bp;GC 含量,44.3%) 使用 Web 服务 GeSeq v1.66 进行注释(cp_Boe 的具体设置: