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1 植物细胞报告 1 焦点文章 2 3 4 dCas9-3xSRDX ...
Lowder, L.G.、Zhang, D.、Baltes, N.J.、Paul III, J.W.、Tang, X.、Zheng, X.、Voytas, D. 121
改进高粱转化和基因组编辑，开发稳定品系，用于光合和水分利用效率分析
通过使用基因组编辑和稳定植物转化技术，开发将高粱基因与表型联系起来的基因组水平知识库以实现生物能源目标，对于理解基本生理功能和作物改良至关重要。我们与参与该项目的各个实验室一起贡献中央枢纽能力，以创建、测试和培育转基因和基因组编辑植物。我们已经建立了可靠的协议，用于通过农杆菌介导将实验性遗传构建体引入高粱 cv BTx430，并合作生成该项目正在进行的研究所需的可行转基因。这些实验包括：； (1) 用于敲低的高粱 RNAi 构建体，例如电压门控氯离子通道蛋白、α碳酸酐酶 7 (CA) 和 9-顺式环氧胡萝卜素双加氧酶 4 以及 myb 结构域蛋白 60； (2) 构建体用于测试磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPC) 启动子表达、CA 过表达和具有改变动力学的 PEPC 的保真度；(3) 旨在测试一系列增加的叶肉 CA 活性的 CA 过表达的其他版本；(4) Ta Cas 9、dTa Cas9 和 dCas9 转录激活因子用于改进编辑，以及；(5) 构建体用于评估转基因过程的改进，旨在增加转化频率并缩短 T1 种子的时间。这些品系目前处于转基因过程的不同阶段。使用形态发生调节剂介导的转化 (MRMT) 的最新发展是实现快速转化和基因组编辑的突破。我们报告了一种使用 MMRT 技术的改进的快速转化方法的开发，该方法有可能增加我们的项目的吞吐量并缩短时间。与 Voytas 实验室合作，我们评估了 MRMT 载体的公共版本。 Voytas 实验室还在测试递送基因组编辑试剂的新方法，特别是使用 RNA 病毒载体通过感染递送 gRNA。通过感染进行可遗传基因编辑已在多个双子叶植物中实现，我们正在努力在狗尾草和高粱中实施该技术。
植物基因编辑不再需要组织培养
植物基因编辑可对植物进行有针对性的改造，在作物的基因功能分析和精准育种方面显示出巨大的潜力[1]。要生产基因编辑植物，需要将基因编辑试剂[2]（例如 CRISPR/Cas9 成分）递送到植物细胞中。这涉及一个漫长、昂贵且劳动密集型的组织培养步骤，而且目前仅在有限数量的植物物种中可行，这成为植物基因编辑的主要瓶颈。在最近一期的《自然生物技术》上，由 Daniel F. Voytas 领导的明尼苏达大学研究小组描述了一种生产基因编辑植物的新方法，同时避免了组织培养的需要（图 1）[3]。该方法利用了分生组织的从头诱导。分化的植物细胞通常不能分裂或产生不同类型的细胞。然而，之前的研究表明，通过异位表达特定的发育调节因子，可以诱导已经分化的细胞形成分生组织。分生组织是包含未分化干细胞（分生细胞）的植物组织，这些干细胞能够进行细胞分裂，并能产生各种组织和器官。例如，在拟南芥中，WUSCHEL ( WUS ) 基因在胚胎发生中起着关键作用，过表达 WUS 可以促进营养生长向胚胎生长的转变 [ 4 ] 。SHOOT MERISTEMLESS ( STM ) 和 WUS 的联合异位表达可激活拟南芥中的一组分生组织功能，包括细胞分裂和器官发生 [ 5 ] 。 ipt 基因位于土壤细菌农杆菌的 Ti 质粒上，该基因编码异戊烯基转移酶，这种酶在植物中诱导细胞分裂素的生物合成，从而刺激器官发生[6]。在单子叶植物中，婴儿潮基因（Bbm）和 WUS 基因的过度表达可促进体细胞形成胚胎，从而提高转化效率[7]。Voytas 研究小组假设分生组织可以在发育调节因子的帮助下诱导。为了验证这一想法，使用多种启动子以不同的组合在本氏烟植物中表达了玉米 WUS2、拟南芥 STM、农杆菌 ipt 和其他发育调节因子。农杆菌用于传递转基因，并以荧光素酶作为报告基因。形成了分生组织状结构，这些结构长成具有荧光素酶表达的转基因植物，并且发现该特性是可遗传的。然后，使用相同的方法，将针对两个测试基因的单个向导 RNA (sgRNA) 与成功组合的发育调节剂一起引入组成性表达 Cas9 的转基因本氏烟叶中。在产生的芽中，可以验证目标基因的编辑，并且发现突变会传递给下一代。随后出现了一个问题，即在土壤中生长的植物上是否也能诱导分生组织。这种方法确实在许多双子叶植物中被证明是成功的，除了本氏烟草，在马铃薯和葡萄中也是如此。此外，还产生了基因编辑的本氏烟草植物，并且发现一些编辑过的植物不含有用于编辑的转基因。从头分生组织诱导方法被称为 Fast-TrACC（快速处理的农杆菌共培养），与传统的组织培养程序相比具有明显的优势（图 1）。首先，它大大缩短了生产基因编辑植物所需的时间，从几个月缩短到几周。其次，Fast-TrACC 不需要无菌条件，并且适用于在土壤中生长的植物。组织培养方法要求使用无菌工作台和无菌培养基，因此无组织培养方法需要的资源更少，并且适用于较小的群体。第三，当 Cas9 与 sgRNA 一起递送时，在某些情况下会产生基因编辑植物
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。