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评估基因治疗产品中基因组编辑脱靶背景下的遗传异质性：FDA 公开研讨会
根据美国食品药品监督管理局 (FDA) 的规定，基因治疗通过转录或翻译转移的遗传物质或特异性改变宿主（人类）基因序列来发挥作用 (FDA 2020)。基因组编辑技术，例如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas 相关核酸酶，包括碱基编辑器，提供了各种工具来高精度地修改基因组 (Li et al. 2020)。这些基因编辑技术极大地加快了基因组编辑基础研究 (Doudna 2020) 和治疗产品的创造速度。尽管这些基因组编辑模式对于高度特异性的基因工程具有巨大的前景，但必须严格审查潜在的脱靶效应，以改进技术并优化其安全性和有效性。意外改变（也称为脱靶或脱靶编辑）的潜在影响是基因组编辑作为一种治疗策略的安全性的关键考虑因素。基因组的意外改变可能是由修改除故意针对的位点以外的 DNA 引起的（美国国家科学院 2017 年）。
为 CRISPR/Cas9 设计引导 RNA 构建体...
水稻 (Oryza sativa L.) 是世界人口（亚洲和非洲）消费最广泛的主食。作为半水生一年生植物，水稻极易因各种环境压力而损失。许多研究表明需要开发耐非生物和生物胁迫的品种 [1] 。标记辅助育种、诱变育种、RNA 干扰、反义技术、ZFN 和 TALEN 等方法被用于开发水稻等作物抗非生物胁迫的优良性状。然而，最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶 (CRISPR/Cas) 系统作为开发作物可遗传基因操作的有效工具而备受关注 [2] 。 2013 年，利用 CRISPR/Cas9 在模式植物拟南芥中成功开发出基于基因组的编辑技术 [3] ，此后，各种作物中已成功编辑了大量与农艺性状相关的基因。这一进步为研究人员开辟了许多新的可能性，包括能够更快地了解生物植物系统。CRISPR 系统主要用于提高不同作物的产量效率、生物强化、生物和非生物胁迫耐受性 [1] 。
crispr/cas9：一种革命性的工具...
通过改善植物农艺性状的基本特征，农业生物技术和基因工程的最新进展为粮食和农业部门带来了许多好处。使用序列特异性核酸酶（SSN）的靶向基因组编辑提供了一种通用方法，用于诱导广泛的生物体和细胞类型的靶向缺失，插入和精确的序列变化。基因组编辑工具，例如siRNA介导的RNA干扰，转录激活剂样核酸酶（Talens）和用于DNA修复的锌 - 纤维核酸酶（ZFN），已广泛用于商业用途。然而，发现CRISPR/CAS9系统作为基因组编辑工具，它彻底改变了生命科学领域。在细菌和古细菌中首次发现了定期间隔的短质体重复序列（CRISPR）作为病毒学防御性DNA段。CRISPR-CAS9作为一种先进的分子生物学技术，可以在任何农作物物种中产生精确的靶向修饰。crispr/cas9由于其效率，特异性和可重复性，该系统被认为是生物技术领域的“突破”。除了其在生物技术领域的应用外，它还广泛用于作物改善中。
第4章通过技术中的植物中的基因表达调制CRISPR/DCAS9
在近几十年内，涉及DNA精确操纵的核酸酶的技术已经发生了深刻的进步，成为了诱导音节突变的有希望的替代方法，并且对基因表达的薄而控制。是基因组编辑，例如核酸酶锌指（锌指核酸酶），具有转录本激活型效应的数字（Talens，英语转录本类核酸酶），以及最近的CRISPR/CAS技术（来自英语粘膜调节性调节性的短与核酶壳相关）。后者具有其革命性，尤其是为了缘故，普遍性和相对简单性（Pickar-Oliver； Gersbach，2019年）。此外，CRISPR/CAS是一种灵活的工具，需要进行修改，这有助于其持续的改进并多样化其在细胞功能和生物技术中的应用。
在人类细胞中进行碱基编辑以产生单核苷酸变体克隆细胞系
碱基编辑技术能够在哺乳动物细胞的目标基因组位点引入点突变，其效率和精度高于采用 DNA 双链断裂的传统基因组编辑方法，例如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR-Cas9（成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 9）系统。这可以更省时省资源地生成单核苷酸变异同源细胞系（即基因组序列仅在单个编辑核苷酸处彼此不同的细胞系）。这些单核苷酸变异克隆细胞系是评估遗传变异在天然细胞环境中的功能作用的有力工具。因此，碱基编辑可以在受控实验室环境中促进基因型到表型的研究，可用于基础研究和临床应用。在这里，我们提供优化的协议（包括实验设计、方法和分析）来设计碱基编辑构建体、转染粘附细胞、批量量化碱基编辑效率以及生成单核苷酸变体克隆细胞系。
从描述性到白血病的功能基因组学，重点是基因组工程技术
摘要：基因组工程使对细胞中DNA序列的精确操纵。因此，这对于理解基因功能至关重要。巨核酸是基因组工程的开始，它继续发现锌纤维核酸酶（ZFN），然后是转录激活剂样效应子核酸酶（Talens）。他们可以在基因组中所需的目标位点产生双链断裂，因此可以用来以相同的方式敲击突变或敲除基因。几年后，通过发现定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）的群集的基因组工程进行了转化。CRISPR系统的实施涉及以RNA为指导的识别和DNA分子的精确分裂。此属性证明了其在表观遗传学和基因组工程方面的效用。crispr曾经并且正在不断成功地用于模拟白血病细胞系和控制基因表达中的突变。此外，它用于识别靶标并发现用于免疫疗法的药物。在本研究中讨论了白血病的描述性和功能基因组学，重点是基因组工程方法。还探索了CRISPR/CAS9系统的挑战，观点，限制和解决方案。
基因组学和人类遗传学年度回顾 基因组编辑技术的技术转移模型
基因组编辑的许多基本发明，包括巨核酸酶、锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR，都是首先在大学中制造并获得专利以鼓励商业开发。这导致了技术转让模式的多样性，但也带来了冲突。在大学专利的更广泛的历史和政策背景以及有关研究工具的特殊挑战的背景下，我们回顾了基因组编辑的专利财产以及用于将其商业化的多种技术转让模式，包括公共领域存储、开放获取合同、材料转让协议、非排他性和排他性许可、代理许可和聚合许可。这种多样性具有优势，它允许进行实验和竞争，我们将其描述为技术转让的联邦主义模式。基因组编辑的一个显着特点是第三方许可中介机构的兴起和成功。与此同时，基因组编辑技术的快速发展可能会削弱专利权和许可制度的重要性，并可能减轻过于宽泛的专利的影响，从而产生新的替代品来实现商业化。
基因组编辑可改善营养质量、...
农业生产依赖于维持人类生命的园艺作物，包括蔬菜、水果和观赏植物。随着人口的惊人增长以及随之而来的对更多食物的需求，增加产量以维持粮食安全已成为必要。传统育种已经补贴了改良品种的发展，但为了提高作物产量，需要获得新的育种技术。CRISPR-Cas9 系统是一种独特而强大的基因组操作工具，可以精确地改变 DNA。该技术基于细菌适应性免疫系统，使用内切酶在单个向导 RNA 的引导下在目标位点产生双链断裂 (DSB)。这些 DSB 可以通过细胞修复机制进行修复，该机制在切割位点安装小的插入和缺失 (indel)。与 ZFN、TALEN 和巨核酸酶等替代编辑工具相比，CRISPR-Cas9 编辑工具因其简单、易用和低脱靶效应而迅速获得快速发展。在许多园艺和工业作物中，CRISPR 技术已成功用于增强抗逆性、自生性、营养改善、风味和代谢产物。基于 CRISPR 的工具是最合适的工具，其预期目标是产生非转基因产量并避免监管障碍，从而将转基因作物推向市场。尽管编辑园艺、工业和观赏作物仍面临一些挑战，但这种新型核酸酶及其作物特异性应用使其成为作物改良的动态工具。
2.4.4 基因组编辑和表观基因组编辑
• 日本在培育有用微生物菌种、改良农畜产品、基因治疗的应用等各开发领域都处于世界领先水平，并通过与大学机构、大企业、风险投资公司、捐赠基金会等密切合作，进一步提高研发能力。 CRISPR Therapeutics、Editas Medicine、Intellia Therapeutics、Beam Therapeutics等多家创业公司正在农作物开发、工业能源开发、人类疾病治疗等领域开展前沿研发。 • 我们已获得CRISPR/Cas9、Cas12、Cas13以及大部分CRISPR相关基础技术和应用技术的知识产权。 • TALAEN 在高油酸大豆的开发和工业应用方面取得了进展。 • 积极推进体内和体外基因组编辑治疗。针对莱伯先天性黑蒙的体内基因组编辑治疗的临床试验已经开始。 • 使用 ZFN 和 CRISPR 的基因组编辑疗法以及更安全的表观遗传编辑疗法的研究、开发和临床试验正在进行中。该公司已在FDA注册了30多项临床试验，在基因治疗研究领域处于世界领先地位。 • 新型核酸检测技术（Sherlock和DETECTR）已经研发成功，正在开发作为新冠病毒的POCT诊断技术。
作物改良方法及加强粮食安全的应用
尽管大量生物（害虫、病原体）和非生物（干旱、寒冷）压力源影响着全球粮食需求，但自文明诞生之日起，农业就支撑着人类的生活。在过去 50 年中，对植物细胞和分子机制的了解不断加深，推动了生物技术的新创新，从而通过植物基因工程引入了所需的基因/特性。锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 和成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 等靶向基因组编辑技术已成为改良作物的有力工具。事实证明，这种新的 CRISPR 技术是一种高效、直接且成本低廉的过程。它适用于大多数植物物种，靶向多个基因，并被用于设计植物代谢途径以产生对病原体和非生物压力源的抵抗力。这些新型基因组编辑 (GE) 技术有望实现联合国“零饥饿”和“良好的人类健康和福祉”的可持续发展目标。这些技术可以更有效地开发转基因作物，并有助于加快美国农业部 (USDA)、食品药品监督管理局 (FDA) 和环境保护署 (EPA) 进行的监管审批和风险评估。