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引用Beatakker，C。W. J.（1991）。量子点电导中库仑阻滞振荡的理论。取自https://hdl.handle.ne
研究设计，大小，持续时间：在小鼠模型中首先优化了CRISPR-CAS9对诱导靶向基因突变的效率。在B6D2F1菌株中比较了两种CRISPR-CAS9递送方法：S期注射（Zygote阶段）（N¼135）ver- SUS Sus-Sus II期（M相）注射（卵母细胞阶段）（卵母细胞阶段）（N¼23）。包括四个对照组：未注射的培养基控制Zygotes（N¼43）/卵母细胞（N¼48）；伪造的Zygotes（n¼45）/卵母细胞（n¼47）; Cas9-蛋白注射的Zygotes（n¼23）;和CAS9蛋白和加扰引导RNA（GRNA）注射的Zygotes（n¼27）。在POU5F1靶向的Zygotes（N¼37），培养基控制Zygotes（N¼19）和假注射的Zygotes（n¼15）中进行了免疫荧光分析（N¼19）（n¼15）。评估POU5F1 -NULL胚胎进一步发展体外的能力，将其他组的POU5F1靶标合子（N¼29）和培养基对照合子（N¼30）培养为种植体后植入阶段（8.5 dpf）。旨在确定归因于菌株变化的POU5F1 null胚胎的发育能力差异，第二个小鼠菌株的Zygotes -B6CBA（n¼52）的目标是针对的。总体而言，在IVM（中期II期）（n¼101）之后，在人卵母细胞中应用了优化的方法。对照组由注射的精子（ICSI）IVM卵母细胞（N¼33）组成。在注入人类CRISPR（n¼10）和培养基对照（n¼9）人类胚胎中进行免疫荧光分析。
全球动物生物技术应用概览...
微注射预复合逆转录病毒SCNT转座子-基于基因组编辑的DNA进入早期DNA，通过精子递送遗传介导的基因组改变阶段受精卵进入受精卵工程细胞整合（ZFNs，TALENs，CRISPR / Cas9）
OBM遗传学在...
使用基因靶向技术创建的抽象基因工程动物长期以来一直被认为是探索感兴趣基因功能的有益，有效和有价值的工具，至少至少在2013年初。然而，这种方法遭受了费力且耗时的任务，例如成功靶向胚胎干细胞（ES）细胞的产生，其表征，携带这些基因修饰ES细胞的嵌合胚泡的产生，以及将操纵囊肿的人移植到受体（Pseudopopeprepepregnant）的女性中，将其移植到chimericers中。由于基因组编辑技术的出现（现在是CRISPR/ CAS9系统的例证）在2013年底，通过基因组编辑成分的前核微介入（MI）在基因组编辑的动物的产生中取得了重大进展，将成分纳入受精的彩蛋（Zygotes）或Zygotes中的Zygotes中。但是，这些程序要求将基因组编辑的胚胎转移到受体女性的生殖道中，以进行进一步发展。通过卵形核酸递送（GONAD）及其修饰的版本（称为“改进的性腺（I-Gonad）”的基因组编辑是作为MI-EP或EP基因组基因组编辑的动物生产的一种替代方法，现在被认为是非常方便的基因组编辑，仅在vivo中表现出lum un lum curvical invi vivo。该系统还可以同时转染卵形腔内的上皮细胞。在这篇综述中，我们总结了性腺/ I -Gonad及其衍生物的最新进展，并讨论了这些技术研究与女性繁殖有关的各种生物系统的潜力。
评估美国各地的点对点电力市场...
摘要遗传修饰（GM）猪的产生被认为是在生物医学研究中为各种疾病和猪开发具有抗病毒感染的动物模型动物的有价值的。可以使用几种方法（例如，使用GM细胞作为SCNT供体，直接注射转基因或基因组编辑成分（GEC）在受精的卵中直接注射到Zygotes中，使用Zygots，使用Zygote的体外电rOpration（Ep）在Zygote中，gecots restrone gececs，gecots，可以使用几种方法，例如使用GM细胞作为SCNT供体，直接注射转基因或基因组编辑成分（GEC），使用Zygotes，使用Zygots的体外电型（EP）在Zygote中，gecots，gecots refofter（ep） GEC进入经过SCNT处理的胚胎，并在GEC存在下经过SCNT处理的胚胎的体外EP。 在我们先前的研究中，我们对基于CRISPR/CAS9的GEC进行了细胞质注射到孤态激活的猪可以使用几种方法，例如使用GM细胞作为SCNT供体，直接注射转基因或基因组编辑成分（GEC），使用Zygotes，使用Zygots的体外电型（EP）在Zygote中，gecots，gecots refofter（ep） GEC进入经过SCNT处理的胚胎，并在GEC存在下经过SCNT处理的胚胎的体外EP。在我们先前的研究中，我们对基于CRISPR/CAS9的GEC进行了细胞质注射到孤态激活的猪
通过将核糖核蛋白电穿孔到Zona-Intact牛胚胎
体细胞核转移或细胞质显微注射已用于产生基因组编辑的农场动物。但是，这些方法具有降低其效率的几个缺点。这项研究旨在开发电穿孔条件，使CRISPR/CAS9系统的传递到牛为有效的基因敲除。我们优化了电穿孔条件，以传递CAS9：SGRNA核糖核蛋白到牛合子，而不会损害胚胎发育。较高的电穿孔脉冲电压导致膜渗透性增加。但是，高于15 v/mm的电压降低了胚胎发育潜力。牛胚胎的Zona卵石不是有效的RNP电穿孔的障碍。使用针对最大膜通透性进行优化的参数，同时我们在靶向牛OCT4时达到了高基因编辑的速率，这导致100％评估的胚胎和预期在莫拉拉阶段对胚胎发育的预期停滞的100％蛋白质。总而言之，CAS9：SGRNA核糖核蛋白可以通过电穿孔到Zona-Intact牛合子的能力递送，从而导致有效的基因敲除。
请引用本文：Toda and Okamoto，（2020）。通过将大分子直接递送到水稻卵细胞中的基因表达和基因组编辑系统
请引用本文：Toda and Okamoto，（2020）。通过将大分子直接递送到水稻卵细胞和受精卵中的基因表达和基因组编辑系统，Bio-protocol 10 (14): e3681。DOI：10.21769/BioProtoc.3681。
通过PCR协议形式的基因分型
等位基因描述：使用优化的CRISPR CAS9 KI技术创建了鼠标R565Q模型，该技术利用核糖核蛋白（RNP）在存在带有所需KI的合成单链DNA修复模板的情况下创建了。zygotes被电穿孔，并通过同源性修复（HDR）筛选后后代，以确定正确靶向等位基因的存在。Ki核苷酸破坏了PAM位点（NGG），为4和5 bp，与裂解位点并设计为SSODN，以保护HDR衍生的基因座免受CAS9自动切割。关键后代。
通过体细胞核转移（SCNT）
这种SCNT卵母细胞的人工激活导致细胞分裂和染色体分离为伪极性体，并以70％的效率下的二核原体。与正常二倍体（n = 46）数量相比，极性体和Zygotes中单个染色体的下一代测序表明，染色体的数量降低了近一半（n = 19）（n = 19）。同源对的全面测序表明，平均将23对同源对的一半（n = 11）正确分离为极体和合子，而剩余的染色体对保持在一起，导致了肾上变。未检测到体细胞同源物之间的重组证据。
使用生殖细胞的基因组编辑方法/......
通过可编程核酸酶（包括成簇调控间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) 系统）进行的定向诱变已被广泛用于生成基因组编辑生物，包括开花植物。迄今为止，在生殖细胞或组织中特异性表达 Cas9 蛋白和向导 RNA (gRNA) 被认为是可遗传定向诱变最有效的基因组编辑方法之一。在本报告中，我们回顾了生殖细胞或组织的基因组编辑方法的最新进展，这些细胞或组织在将遗传物质传递给下一代方面发挥着作用，例如卵细胞、花粉粒、合子、未成熟合子胚和茎尖分生组织 (SAM)。 Cas9 蛋白在起始细胞中的特异性表达可有效诱导农杆菌介导的植物转化中的靶向诱变。此外，通过将 CRISPR/Cas9 成分直接递送到花粉粒、受精卵、胚胎细胞和 SAM 中，已成功建立基因组编辑，以生成基因组编辑的植物系。值得注意的是，通过递送 Cas9-gRNA 核糖核蛋白 (RNP) 进行的无 DNA 基因组编辑与任何有关转基因生物的立法问题无关。总之，生殖细胞或组织的基因组编辑方法不仅对植物生殖的基础研究具有巨大潜力，而且对分子植物育种的应用科学也具有巨大潜力。
细胞周期阶段和 DNA 修复途径影响猪胚胎中 CRISPR/Cas9 基因编辑效率
摘要：CRISPR/Cas9 技术是一种用于在不同细胞类型和物种中操作基因组的强大工具。然而，与所有新技术一样，它仍然需要改进。不同的因素会影响 CRISPR/Cas 在受精卵中的效率，从而影响创建大型动物研究模型的总成本和复杂性。本研究评估了 CRISPR/Cas9 成分注射时早期注射（激活/受精后 6 小时内）与晚期注射（激活/受精后 14-16 小时）受精卵细胞周期阶段的重要性，以及 DNA 修复的同源重组 (HR) 途径的抑制对受精、精子注射、体细胞核移植和孤雌激活技术产生的胚胎的基因编辑、胚胎存活和发育的影响。与早期注射（86.3%；28.8%）相比，晚期细胞周期注射降低了胚胎存活率（以未裂解胚胎的比例衡量）和囊胚形成率（68.2%；19.3%）。然而，晚期注射（73.8%）的囊胚基因编辑率高于早期注射（63.8%）的囊胚。抑制 HR 修复通路可使早期注射的囊胚基因编辑效率提高 15.6%，而不会影响胚胎发育。我们的研究结果表明，在早期细胞周期注射以及 HR 抑制可提高猪囊胚的受精卵活力和基因编辑率。