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血斑卡上动物粪便物质的 DNA 提取方案
159 图 2. 实验设置以确定适用于 DBS 的 DNA 提取和纯化方案 160。测试的不同方法是 DNA_P1) QIAsymphony® PowerFecal® Pro DNA 161 试剂盒（目录号 938036，Qiagen），包括在 FastPrep-24™ Classic 162 上以 6 m/s 的速度进行 6 轮均质化 162 60 秒，中间休息 5 分钟，然后用 163 蛋白酶 K 600 mAU/ml（Qiagen）消化，然后在 QIAsymphony® SP 164 机器人（Qiagen）上进行自动纯化。DNA_P2) 执行与 DNA_P1 相同，但不进行蛋白酶 K 处理。 DNA_P3) ZymoBIOMICS™ DNA Miniprep Kit (Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) 经 FastPrep-24™ Classic 匀浆化后，以 6m/s 的速度匀浆 60 秒，共 6 轮，中间间隔 5 分钟。DNA_P4) MagNA Pure 96 DNA 和 Viral NA 小容量试剂盒在 MagNA Pure 96 仪器 (Roche, Basel, Switzerland) 上进行，采用蛋白酶 K 预处理步骤和标准缓冲液，使用针对双链 DNA 和下一代测序优化的 DNA Blood ds SV 方案。其中，DNA_P1、DNA_P2、DNA_P3 和 DNA_P4 用于从模拟物、空白和猪粪便中提取 DNA，DNA_P1 在所有研究动物的粪便上进行性能测试，此外还对阳性和空白对照进行了三份重复测试。使用 DNA_P1 从牛、马、犬、羊和猪的粪便中提取 DNA，并在 Illumina NovaSeq 上进行测序，从每个样本中生成 >2000 万个 PE 读数。这些数据集用于告知所需的测序工作量。
使用第三代测序优化从鼻衬液中提取DNA，以评估鼻微生物组
背景：通过鼻吸附对鼻衬液（NLF）采样最少侵入性且耐受性良好，但是使用此技术评估鼻微生物组的可行性尚不清楚。但是，低生物量使气道样品特别容易受到与污染物DNA有关的问题。在这项研究中，我们评估了使用方法学对低生物量呼吸样品分离的DNA的适用性，并评估了与传统的拭子采样方法相比，通过鼻吸附收集的衬里液的衬里如何捕获鼻微生物的多样性和组成。方法：从成年志愿者那里收集鼻拭子和NLF。DNA。评估DNA的质量和数量，并进行了短阅读16S rRNA测序，以评估可行性和提取偏见。然后使用优化的提取方法从NLF和鼻拭子中提取DNA，并且进行了全长16S rRNA测序，以比较NLF和鼻拭子之间的微生物谱。使用NF核/Ampliseq管道，PacificBiosciences/PB-16S-NF管道或软件EMU分类分类法分类，并使用R Packages Temages and Mixomics进行下游分析。结果：所有提取方法均从模拟群落中恢复了DNA，但仅基于降水的方法从NLF产生了足够的DNA。提取方法显着影响微生物谱，需要机械裂解以最大程度地减少针对特定属的偏差。曲线与长读测序相当。结论：我们的发现证明了使用通过鼻吸附收集的NLF分析鼻微生物组的可行性，并验证了两种提取方法，作为适合全长的16S rRNA测序的低生物量呼吸类样品的RRNA测序。我们的数据证明了在低生物量呼吸样品中无偏DNA提取方法的重要性，以及随后DNA提取对观察到的微生物谱的影响。此外，我们证明了NLF可能是使用16S rRNA测序评估鼻拭子的适当替代样品。