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hamilton ngs ngs star v
生物学资格结果通过准备NGS库来评估hamilton ngs Star V上的Qiagen QiaSeq FX DNA方法的性能，并使用QIASEQ FX FX DNA库套件具有重复性，以下是不同的样品Buffer EB。进行了三种生物运行；两个使用大肠杆菌gDNA（DH10B）和QIASEQ珠或Agencourt Ampure XP珠（包括1个阴性对照）和一个使用Microbial社区组成ATCC MSA-1003（20个菌株），ATTC MSA-1001（10菌株）和E. Coli Gdna（dhsec）和QH10B（DH10B）（包括12个菌株）（包括12个菌株）和QASE（dhsseq）（QIACE）（QIACE），使用了八个样品，其中有八个样品和QIASEQ珠子或QIASEQ珠子或Agencourt Ampure XP珠（包括1个阴性对照）。在运行期间施加了10分钟的碎片时间和七个PCR周期。用于文库制备的生物学资格，用定量1x DSDNA HS分析套件确定最终文库浓度。随后，八样本运行的所有库的库大小分布，
重组工程：利用同源重组进行细菌遗传工程”。引自：分子生物学最新协议
细菌染色体和细菌质粒可通过同源重组在体内进行改造，使用 PCR 产物和合成寡核苷酸作为底物。这是可能的，因为噬菌体编码的重组蛋白可以有效地重新组合同源序列，这些序列短至 35 到 50 个碱基。重组允许插入或删除 DNA 序列，而不考虑限制位点的位置。本单元首先描述了表达重组功能的电转化感受态细胞的制备及其用 dsDNA 或 ssDNA 的转化。然后，它介绍了支持协议，这些协议描述了几种两步选择/反选择方法，这些方法可以在不留下目标 DNA 中任何不必要的变化的情况下进行遗传改变，以及一种从大肠杆菌染色体或共电穿孔 DNA 片段中将遗传标记（通过检索进行克隆）检索到质粒上的方法。附加方案描述了筛选未选择突变的方法、从重组菌株中去除有缺陷的原噬菌体的方法和其他有用的技术。Curr. Protoc. Mol. Biol. 106:1.16.1-1.16.39。C 2014 by John Wiley & Sons, Inc.
组织和液体活检样本中的敏感变异分析
根据 Illumina 无细胞 DNA 富集制备用户指南中的详细说明，从碎片化的 FFPE DNA 或 cfDNA 制备 Illumina 无细胞 DNA 富集制备文库。对于 FFPE DNA，超声处理后，将 45 μl 碎片 DNA（~40 ng）转移到 96 孔 PCR 板中以进行最终修复反应。对于 ctDNA 样本，将 20 ng DNA 输入文库制备中。对“浓缩索引文库”步骤进行了更改，按质量而不是体积进行汇集，以适应在本研究期间测试的单个文库制备中的 1 重、4 重和 12 重文库汇集。使用 Qubit dsDNA BR 检测（Thermo Fisher Scientific，目录号 Q32853）对文库进行量化。为了适应更大的体积，每个文库汇集了 250 ng，并对协议进行了一些修改。富集是使用定制的 79 基因探针面板进行的，如 Illumina 无细胞 DNA 富集准备用户指南中所述。
使用切口酶进行选择性线粒体 DNA 碱基编辑
线粒体内膜的物理和化学特性对常用于核基因组碱基编辑的CRISPR系统提出了挑战，因为其向导RNA不能轻易进入线粒体来编辑线粒体DNA（mtDNA）1。此外，之前鉴定的DNA脱氨酶主要针对单链DNA（ssDNA），这限制了它们在线粒体DNA碱基编辑器的开发中的应用。然而，可以修饰双链DNA（dsDNA）中胞嘧啶的DddA脱氨酶的发现，使得开发线粒体DNA碱基编辑器成为可能，例如DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）和转录激活因子样效应物（TALE）连接的脱氨酶（TALED）2,3。这些工具依赖于 DddA，但受到其序列偏好以及通过与转录抑制因子 CTCF 4 相互作用对核基因组产生脱靶效应的风险的限制。此外，DdCBE 和 TALED 会编辑目标序列的两条链 2 , 3 ，从而导致不准确。这些限制阻碍了这些工具在研究和治疗由线粒体DNA突变引起的疾病中的应用。
croft-seq
图1。Croft-seq的示意图。（a）具有gDNA（橙色）的链球菌Cas9的示意图，与距离dsDNA（绿色）结合，其中包含与NGG PAM序列（黄色）近端的错配（红色）。（b）Croft-Seq工作流的简化示意图。人类基因组DNA在用Cas9核酸酶消化之前用磷酸酶处理。将所得的DNA末端选择性地绑扎到生物素化衔接子上。然后除去适配器的过量，然后将连接的DNA富含磁珠富集。除去互补的非生物素化DNA链，并合成新的第二个DNA链。所得的DNA从珠子中释放出来，并通过PCR扩增进行测序。（c）Croft-seq生物信息学分析的工作流程。成对末端读数，测序和清洁残留适配器序列，首先与参考基因组保持一致。对齐的读数，该脚本使用4 bp读取窗口搜索陡峭的读取深度变化，并优先考虑潜在的脱离目标脱离靶向的读数和目标序列相似性的双向。只有靶向位置
基因组编辑
比较 EnGen Spy Cas9 NLS、EnGen Spy Cas9 HF1 和其他市售高保真 Cas9 变体的引导 RNA 序列与靶 DNA 序列之间的错配容忍度。允许编码与荧光标记的 dsDNA 底物单、双或三错配的几种引导 RNA 之一与五种 Cas9 变体中的每一种形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。包括完全匹配的引导 RNA 作为对照。将 RNP 与底物以 2:1 的比例在 37°C 下孵育 5 分钟。通过毛细管电泳测量每个 RNP 复合物的底物裂解百分比。结果绘制为热图，白色表示无裂解，蓝色强度增加表示裂解百分比增加。每行均标明引导 RNA 序列，错配以绿色表示。 DNA 原型间隔序列为 5´ – AGAACTGGCAGAGGAGGTAG – 3´，原型间隔相邻基序 (PAM) 为 5´– TGG – 3´。EnGen Spy Cas9 HF1 显示出最高的靶向切割与平均脱靶切割比率，从而表明对错配的敏感性增加。
基因组编辑
比较 EnGen Spy Cas9 NLS、EnGen Spy Cas9 HF1 和其他市售高保真 Cas9 变体的引导 RNA 序列与靶 DNA 序列之间的错配容忍度。允许编码与荧光标记的 dsDNA 底物单、双或三错配的几种引导 RNA 之一与五种 Cas9 变体中的每一种形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。包括完全匹配的引导 RNA 作为对照。将 RNP 与底物以 2:1 的比例在 37°C 下孵育 5 分钟。通过毛细管电泳测量每个 RNP 复合物的底物裂解百分比。结果绘制为热图，白色表示无裂解，蓝色强度增加表示裂解百分比增加。每行均标明引导 RNA 序列，错配以绿色表示。 DNA 原型间隔序列为 5´ – AGAACTGGCAGAGGAGGTAG – 3´，原型间隔相邻基序 (PAM) 为 5´– TGG – 3´。EnGen Spy Cas9 HF1 显示出最高的靶向切割与平均脱靶切割比率，从而表明对错配的敏感性增加。
DNA 浓度测定
确保为所有样品和 2 个标准品提供足够的工作停止位。 2. 将 190 µl 工作原液分装到 Qubit 管中，用于两个标准品。 3. 将 198 µl 工作原液分装到 Qubit 管中，用于每个样品。 4. 向每个标准品管中加入 10 µl 适当的标准品。加入后短暂涡旋。应在样品之前完成，以确保在室温下孵育至少 3 分钟 5. 将 2 µl 的每个样品加入每个样品管中。加入后短暂涡旋。 6. 在仪器上选择左下方的 home，然后选择 dsDNA BR 检测，然后选择“是”以读取新标准品。如果打算将数据传输到存储卡，最好先通过选择右下方的数据然后清除数据来清除数据。 7. 按照屏幕上的说明读取两个标准品和第一个样品。温度会影响检测，因此在将管放入仪器之前，请避免用手过度握住管子以使其变热，并在放入后迅速选择“读取”
胜任的细胞
比较Engen间谍Cas9 NLS，Engen Spy Cas9 HF1的指南RNA序列和目标DNA序列之间的不匹配的耐受性，以及其他商业可用的高保真cas9变体。与荧光标记的DsDNA底物编码单个，双或三倍不匹配的几个指南RNA之一，可以与五个Cas9变体中的每一个形成核糖核蛋白（RNP）复合物。将完全匹配的导向RNA作为对照包括。将RNP与底物在37°C下以2：1的比率孵育5分钟。通过毛细管电泳测量每个RNP复合物的底物裂解百分比。的结果是作为热图的图形图形，白色代表没有裂解和蓝色强度的增加，表明裂解百分比增加。指南RNA序列在每一行中指示，并以绿色表示不匹配。DNA原始序列序列为5´ - agaactggcagagaggagggtag - 3´，而原始的邻接基序（PAM）为5´– TGG - 3´。Engen间谍Cas9 HF1通过显示出靶向裂解与平均脱靶裂解的最大比例，表现出对不匹配的敏感性提高。
具有富含 C 的 PAM 识别功能的新型 CRISPR 型 V 核酸酶家族
大多数 CRISPR 型 V 核酸酶在富含 T 的 PAM 刺激下切割双链 (ds) DNA 靶标，这限制了它们的靶向范围。在这里，我们鉴定并表征了一个新的型 V RNA 引导核酸酶家族 Cas 12l，它专门识别富含 C 的 (5'-CCY-30) PAM。其 CRISPR 基因座内的基因组织类似于 II-B 型 CRISPR-Cas 9 系统，但序列分析和功能研究均将其确立为一个新的型 V 效应物家族。生化实验表明，Cas 12l 核酸酶在 37 至 52°C 之间发挥最佳功能，具体取决于直系同源物，并优先切割超螺旋 DNA。与其他型 V 核酸酶一样，它表现出由 ssDNA 或 dsDNA 靶标识别触发的附带非特异性 ssDNA 和 ssRNA 切割活性。最后，我们表明，一个家族成员 Asp 2 Cas 12 l 可以在异源细胞环境中发挥作用，这表明这一组新的 CRISPR 相关核酸酶可以被用作基因组编辑试剂。