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额肌 - NSF-PAR - 国家科学基金会
242 图 5：组蛋白 H2B 的 NLS 序列将厌氧荧光报告基因定位到真菌细胞的细胞核 243。A) 厌氧真菌在组蛋白 H2B 上具有独特的 5' 前导序列，与模型真菌谱系的前导序列不同。B) 保守厌氧真菌组蛋白 245 2B 前导序列或假定 NLS 的一致序列。C) 用含有潮霉素抗性和 iRFP 的构建体转化的真菌细胞的共聚焦显微镜检查能够选择和可视化 iRFP 表达。有关这些构建体的完整描述，请参阅表 2。248 249
CALIPERS：用于表型分析实验和再生研究的细胞周期感知活体成像
1. 意大利帕维亚大学合成生理学实验室 2. 意大利米兰人类科技城 3. 意大利都灵大学“Guido Tarone”分子生物技术中心 * 通讯作者：francesco.pasqualini@unipv.it；moises.disante@unipv.it 摘要 在活细胞成像中测量细胞结构和功能以及细胞周期进程一直很有挑战性，因为荧光泛素细胞周期指示剂 (FUCCI) 和大多数表型传感器都使用绿色 (GFP) 和红色 (RFP) 荧光蛋白。我们介绍了 CALIPERS，一种用于表型分析实验和再生研究的细胞周期感知活细胞成像方法。CALIPERS 使用一种名为 FUCCIplex 的定制 FUCCI 传感器，该传感器与基于 GFP 和 RFP 的传感器进行光谱多路复用。为了证明 CALIPERS 的广泛应用范围，我们用上皮和人类诱导性多能干细胞多色报告基因系在增殖、迁移、心脏药物检测和再生医学研究中对其进行了验证。正文组学和成像技术的融合为基础科学 1,2 、药物检测 3 和再生医学 4 中的细胞表型的高级评估提供了动力。此外，参考人类诱导性多能干细胞 (hiPSC) 和多谱系分化的强大协议（例如心肌细胞、hiPSC-CM）增强了可重复性 5 ，并将表型分析工作扩展到类器官 6,7 和器官芯片 8,9。然而，细胞周期 (CC) 可能会混淆这些研究，因为随着细胞在分裂后生长（G1 期）、复制其 DNA（S）、在随后的分裂前生长（G2）或分裂（M）10 ，基因表达、形态和行为会发生变化。这在分子表型分析中得到了很好的解决，因为由于同时测量许多 CC 基因/蛋白质 11 ，大多数组学研究都具有 CC 感知能力。然而，基于成像的 CC 感知表型分析具有挑战性。通过对 G1/S/G2/M 标记物进行特定染色，可以使化学固定样品的结构表型分析具有 CC 感知能力 12 。然而，功能表型分析只有通过活细胞成像 13,14 才有可能，目前很难使用标准荧光显微镜同时评估 CC 以及细胞结构和功能。事实上，绿色和红色荧光蛋白 (GFP、RFP) 为荧光泛素细胞周期指标 (FUCCI) 10 和大多数表型传感器 15 提供动力。在这里，我们引入了一个可复用的 FUCCI 传感器 FUCCIplex，并展示了 CC 感知实时成像，用于人类上皮细胞（HaCaT，图 1）和 hiPSC（图 2）中的表型分析实验和再生研究（CALIPERS）。为了创建 FUCCIplex，我们将 fastFUCCI 传感器 16 中的 GFP 和 RFP 替换为 miRFP670（iRFP）和 mTurquoise2（CFP）。因此，FUCCIplex 细胞的细胞核在 G1 中包含 CFP，在 G1-S 过渡期包含 CPF 和 iRFP，在 S/G2/M 期仅包含 iRFP（图 1a）。为了展示 CALIPERS，我们在 HaCaT 细胞中共表达了 FUCCIplex 和肌动蛋白结合肽 RFP-LifeAct 17，并使用 40 小时以上的活细胞荧光成像来追踪细胞在每个 CC 期所花费的时间（图 1b 和补充视频 1 和 2）。我们证实 HaCaT 细胞约 40% 的时间处于 G1 期，其余时间处于 S/G2/M 期，这与使用 FUCCIplex 或 DNA 标记在静态图像和流式细胞术实验中测得的 CC 期占有率一致（图 1c-d 和扩展图 1）。此外，我们开发了一个开源插件，可将 CFP 和 iRFP 强度转换为 FUCCIphase 信号，该信号可追踪 CC 完成百分比并实现 CC 感知的形态和运动分析（图 1e、补充视频 3 和扩展图 2）。
黑色素瘤细胞的铁死亡易感性
缩写：SMA，α平滑肌肌动蛋白；AA，氨基酸；BME，Eagle基础培养基；BMP4，骨形态发生蛋白-4；BFP，蓝色荧光蛋白；CoQH2，还原辅酶Q；CHP，氢过氧化异丙苯；DR，耐药；EBSS，Earle平衡盐溶液；EGF，表皮生长因子；FBS，胎牛血清；eIF2，真核起始因子2α；FACS，荧光激活细胞分选术；FITC，异硫氰酸荧光素；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；GFP，绿色荧光蛋白；GSH，谷胱甘肽；GSSG，谷胱甘肽二硫化物；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶4；HGF，肝细胞生长因子；HPLM，人血浆样培养基； iRFP，近红外荧光蛋白；Mel-MPM，黑色素瘤导向模块化生理培养基；MPM，模块化生理培养基；NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAMPT，烟酰胺磷酸核糖转移酶；NAMPTi，烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂；NEAA，非必需氨基酸；NHDF，正常人真皮成纤维细胞；PI，碘化丙啶；ROS，活性氧；Se，亚硒酸盐；SLC3A2，溶质载体家族 3 成员 2；SLC7A11，溶质载体家族 7 成员 11；xCT，胱氨酸/谷氨酸转运蛋白