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BAd-CRISPR：在成年小鼠肩胛间棕色脂肪组织中诱导基因敲除
CRISPR/Cas9 已实现多种组织中的可诱导基因敲除；然而，尚未有其在棕色脂肪组织 (BAT) 中的应用报道。在此，我们开发了棕色脂肪细胞 CRISPR (BAd-CRISPR) 方法来快速检测一个或多个基因的功能。使用 BAd-CRISPR，将表达单向导 RNA (sgRNA) 的腺相关病毒 (AAV8) 直接施用于在棕色脂肪细胞中表达 Cas9 的小鼠的 BAT。我们表明，将 AAV8-sgRNA 局部施用于成年小鼠的肩胛间 BAT 可强有力地转导棕色脂肪细胞，并使脂联素、脂肪甘油三酯脂肪酶、脂肪酸合酶、周脂素 1 或硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1 的表达降低 90% 以上。施用多个 AAV8 sgRNA 可同时敲除多达三个基因。 BAd-CRISPR 诱导移码突变并抑制靶基因 mRNA 表达，但不会导致 BAT 中脱靶突变的大量积累。我们利用 BAd-CRISPR 创建了可诱导的解偶联蛋白 1 (Ucp1) 敲除小鼠，以评估 UCP1 缺失对成年小鼠适应性产热的影响。可诱导的 Ucp1 敲除不会改变核心体温；然而，BAd-CRISPR Ucp1 小鼠的成纤维细胞生长因子 21 循环浓度升高，并且 BAT 基因表达发生变化，与通过增加过氧化物酶体脂质氧化而产生的热量一致。其他分子适应性预示着额外的细胞效率低下，蛋白质合成和周转增加，线粒体对线粒体编码基因表达的依赖降低，核编码线粒体基因表达增加。这些数据表明 BAd-CRISPR 是一种加速脂肪组织生物学发现的有效工具。
RNA 引导的 AsCas12a 和 SpCas9 催化敲除...
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2021 年 11 月 23 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.11.15.468743 doi：bioRxiv preprint
程序性敲除同种异体移植后，光滑双脐螺胚胎细胞系对曼氏血吸虫孢囊的粘附性降低
转染的 Bge 细胞以评估 Cas9 的表达（图 1b）。使用两对引物进行 PCR，以对照或 pCas-BgAIFx4 转染的 Bge 细胞的 cDNA 作为模板，一对引物针对 Cas9，另一对针对 BgActin，后者是 B. glabrata 的肌动蛋白基因，用作参考基因（图 1b、c）。转染后 24 小时检测到瞬时 pCas-BgAIFx4 转染的 Bge 细胞中编码 Cas9 的转录本，并在测定的 9 天内保持表达。在 pCas-BgAIFx4 转染的细胞中观察到 Cas9 mRNA（277 bp）的特异性扩增子，但在未转染的细胞中没有观察到（图 1c）。我们的研究结果支持了先前的研究结果，即揭示了 Bge 细胞中由荧光素酶驱动的 CMV 启动子 [60]。对照参考 BgActin 的表达在 214
RNA 引导的 AsCas12a 和 SpCas9 催化敲除...
寡核苷酸和基于序列的试剂 PCR 引物 本研究 从 IDT ssODN 合成 Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 Ultramer DNA Oligos， 从 IDT 合成向导 RNA Ittiprasert 等人，2019 年和本研究 从 IDT 合成 化学品、酶和其他试剂 Alt-R® CRISPR-Sp HiFi Cas9 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081060 Alt-R® CRISPR-AsCas12a 酶 V3 Integrated DNA Technologies 1081068 DNAzol® ES 试剂 Molecular Research Center DN127 RNAzol® RT 试剂 Molecular Research Center RN190 Opti-MEM FisherScientific Gibco™ 31985062 DMEM FisherScientific 88364 胎牛血清 FisherScientific Gibco™ 26140079 100x 青霉素-链霉素-两性霉素 B FisherScientific SV30079.01 NucleoSpin® 凝胶和 PCR 纯化 Takara 740609
Mei Yen Man，Mohd Saberi Mohamad*，Yee Wen Choon和Mohd Arfian Ismail在Silico Gene敲除预测中，使用BAT算法和minimiz
摘要：微生物通常会生产许多高需求的工业产品，例如燃料，食品，维塔米和其他化学物质。微生物菌株是微生物的菌株，可以通过代谢工程进行优化以改善其技术特性。代谢工程是克服细胞调节以获得所需产品或生成宿主细胞通常不需要产生的新产品的过程。遗传操作（例如基因敲除）的预测是代谢工程的一部分。基因敲除可用于优化微生物菌株，例如最大化感兴趣的化学品的产量。代谢和基因工程对于培养感兴趣的化学物质很重要，因为没有它们，许多微生物的产物通常很低。结果，本文的目的是提出蝙蝠算法和代谢调节（BATMOMA）的最小化的组合，以预测哪些基因敲除，以提高埃斯切里希亚大肠杆菌（E. Coli）中的琥珀酸和乳酸产量。
CRISPR-CAS9介导的SAGD基因的敲除链球菌中链霉菌酶过表达的敲除
链球菌酶是一种酶，在某些心肌梗死（心脏病发作），肺栓塞和动脉血栓栓塞症的情况下，可以分解血凝块。由于各种心脏病的发病率增加，链霉菌酶的需求在全球范围内高。链球菌酶的主要来源是来自链球菌的各种菌株。链霉菌酶在天然菌株链球菌中的表达受到限制，这是由于SAGD抑制剂基因用于生产链霉菌酶，需要将其淘汰以增加表达。然而，FASX是A组中存在的一个小RNA（SRNA），它通过在SKA mRNA的5'端结合，负责链球菌酶（SKA）基因的转录后调节。s。episimilis是β-蛋白酶蛋白产生链球菌细菌（C组），其中含有FASX的直系同源物，并且本质地表达了临床上重要的溶栓链蛋糕激酶。是为了提高mRNA的稳定性并增加链霉菌酶的表达，而链霉菌酶抑制了SAGD。与野生型相比，我们使用CRISPR-CAS9成功地从SAGD基因中淘汰，并观察到突变株中链球菌表达的相对定量的13.58倍。我们还证明了使用CRISPR-CAS9在Equisimilis中的成功靶基因敲除，可以进一步用于过表达链霉菌酶用于治疗应用。
CRISPR-Cas9 介导敲除木薯 CYP79D1 和 CYP79D2 可减弱有毒氰化物的产生
木薯 (Manihot esculenta Crantz) 是一种富含淀粉的块根作物，养活了全世界热带和亚热带地区超过 10 亿人。然而，这种主食会产生有毒的氰化物，需要经过加工才能安全食用。过量食用加工不充分的木薯，再加上缺乏蛋白质的饮食，会对神经退行性产生影响。由于木薯的杂合性质，通过常规育种降低氰化物含量存在问题；重组通常会破坏克隆繁殖品种的一系列理想性状。为了降低木薯中的氰化物水平，我们使用 CRISPR 介导的诱变技术来破坏细胞色素 P 450 基因 CYP79D1 和 CYP79D2，这两个基因的蛋白质产物可催化氰化物葡萄糖苷生物合成的第一步。敲除这两个基因可消除木薯品种 60444 和西非农民偏爱的品种 TME 419 的叶子和块茎中的氰化物。虽然单独敲除 CYP79D2 可显著减少氰化物，但诱变 CYP79D1 则不会，这表明这些旁系同源物的功能已经出现分化。我们的工作表明，木薯基因组编辑可提高食品安全、降低加工要求并带来环境效益，这些优势可轻松扩展到其他农民偏爱的品种。
靶向敲除基因OSHOL1去除水稻植物的甲基碘化物排放
碘缺陷代表了全球一个公共卫生问题。为了增加饮食中碘的量，已经尝试了植物的生物强化策略。他们依靠碘的外源给药来增加其吸收和积累。但是，碘在植物中不稳定，可以通过由无害对臭氧层（HOL）基因编码的特定甲基转移酶的作用挥发为碘化甲基。大气中碘化甲基的释放是由于其臭氧耗竭潜力而对环境的威胁。稻田是碘化甲基最强的生产者之一。因此，碘生物化化的农艺学方法不适合这种作物，从而进一步增加了碘排放。在这项工作中，我们使用了基因组编辑CRISPR/CAS9技术来淘汰稻米基因并研究其功能。oshol1由于淘汰赛废除了该过程，因此导致了碘化甲基甲基生产的主要参与者。此外，它的过表达加强了它。相反，Oshol2的敲除未产生效果。我们的实验有助于阐明水稻基因的功能，提供工具来开发新的水稻品种，并减少碘排放，因此更适合于生物实力化计划而不进一步影响环境。
利用 CRISPR/Cas9 介导的基因工程产生催乳素诱导蛋白 (Pip) 基因敲除小鼠
完整作者列表： Terceiro, Lucas；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，病理学系 Blanchard, Anne；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，病理学系 Edechi, Chidalu；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，病理学系 Fresnoza, Agnes；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，生物化学和医学遗传学系 Triggs-Raine, Barbara；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，生物化学和医学遗传学系 Leygue, Etienne；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，生物化学和医学遗传学系；曼尼托巴癌症护理中心，肿瘤学和血液学研究所 Myal, Yvonne；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，病理学系；曼尼托巴大学马克斯拉迪医学院，生理学和病理生理学系；马尼托巴癌症护理中心，肿瘤学和血液学研究所