thermocellum

纤维素分解菌热纤梭菌中 IB 型和 II 型 CRISPR/Cas 基因组编辑系统的开发

C. thermocellum 强大的木质纤维素溶解活性使其成为生物燃料生产综合生物加工的最佳候选者。C. thermocellum 的遗传技术落后于模式生物，从而限制了改进生物燃料生产的尝试。为了提高对 C. thermocellum 进行工程改造的能力，我们表征了天然的 I-B 型和异源的 II 型成簇的规律间隔短回文重复 (CRISPR)/cas（CRISPR 相关）系统。我们将天然的 I-B 型系统重新用于基因组编辑。我们测试了三种嗜热 Cas9 变体（II 型），发现从 Geobacillus stear-othermophilus 中分离的 GeoCas9 在 C. thermocellum 中具有活性。我们采用 CRISPR 介导的同源定向修复将无义突变引入 pyrF 。对于这两种编辑系统，修复模板和基因组之间的同源重组似乎是限制步骤。为了克服这一限制，我们测试了三种新型嗜热重组酶，并证明从 Acidithiobacillus caldus 中分离的 exo / beta 同源物在 C. thermocellum 中具有功能性。对于 I-B 型系统，一种名为 LL1586 的工程菌株在 pyrF 基因座处产生了 40% 的基因组编辑效率，当表达重组机制时，这一效率增加到 71%。对于 II 型 GeoCas9 系统，观察到 12.5% 的基因组编辑效率，当表达重组机制时，这一效率增加到 94%。通过将嗜热 CRISPR 系统（I-B 型或 II 型）与重组酶相结合，我们开发了一种可实现高效 CRISPR 编辑的新工具。现在，我们准备利用 CRISPR 技术更好地改造 C. thermocellum，以增加木质纤维素降解和生物燃料生产。