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基于单细胞打印技术和乳液偶联分析对 CRISPR/Cas9 RANKL 敲除间充质干细胞克隆进行表征，作为单细胞克隆的低细胞工作流程
基因改造单细胞的同质性对于许多应用（例如细胞系开发、基因治疗和组织工程，尤其是再生医学应用）而言是必需的。缺乏有效分离和表征 CRISPR/Cas9 工程细胞的工具被认为是这些应用中的一个重大瓶颈。尤其是蛋白质检测技术不兼容，无法在没有先决条件大规模克隆扩增的情况下确认蛋白质表达变化，这在许多应用中造成了僵局。为了改善工程细胞的表征，我们提出了一种改进的工作流程，包括基于高产量荧光特性的单细胞打印/分离技术、基因组编辑筛选（测量测定）、评估改变的基因表达的 mRNA rtPCR 和一种称为乳化偶联的多功能蛋白质检测工具，以提供高含量、统一的单细胞工作流程。该工作流程以 RANKL 敲除永生化间充质干细胞的工程和功能验证为例，这些细胞的骨形成能力发生了改变。由此产生的工作流程经济实惠，无需大规模克隆扩增细胞，整体克隆效率高于 CRISPR/Cas9 编辑细胞的 30%。尽管如此，由于单细胞克隆在细胞发育的早期高度并行阶段得到全面表征，包括 DNA、RNA 和蛋白质水平，因此该工作流程可提供更多成功编辑的细胞以供进一步表征，从而降低开发过程中后期失败的可能性。
血清素 2C 受体的 RNA 编辑与酒精摄入
血清素 2C 受体 (5-HT 2C R) 属于与 G 蛋白偶联的七个跨膜结构域受体 (GPCR) 超家族。它广泛分布于中枢神经系统，在边缘系统中表达相对较高，包括杏仁核、伏隔核 (NAc)、海马和下丘脑。根据其表达模式和大量药理学研究，5-HT 2C R 被认为参与各种大脑功能，包括情绪、食欲和运动行为。在这里，我们回顾了 5-HT 2C R 及其与酒精摄入的关系，特别关注 5-HT 2C R mRNA 编辑的参与及其与小鼠酒精偏好的关系。RNA 编辑是一种转录后修饰机制。在哺乳动物中，腺苷通过脱氨酶 ADAR1 和 ADAR2 转化为肌苷。5-HT 2C R 是唯一在编码区内进行 RNA 编辑的 GPCR。它在外显子 5 中有五个编辑位点，编码第二个细胞内环。因此，未编辑受体 (INI) 的三个氨基酸残基 (I156、N158 和 I160) 可能会改变为不同的编辑异构体，从而导致受体活性（如 5-HT 效力和 G 蛋白偶联）发生变化。NAc 中的 5-HT 2C R 与长期酒精暴露后的饮酒增强有关，5-HT 2C R mRNA 编辑的改变对于使用不同品系的小鼠和转基因小鼠确定酒精偏好非常重要。该受体的 RNA 编辑可能参与酒精中毒的发展。
针对线粒体的三苯基膦基化合物通过 Erk1/2 防止线粒体功能障碍，从而抑制肥大细胞 FcεRI 依赖性脱颗粒
目的：肥大细胞（MC）Fc ε RI依赖性激活和脱颗粒在过敏性疾病中起重要作用。我们之前已证明基于三苯基膦（TPP）的抗氧化剂SkQ1可抑制肥大细胞脱颗粒，但这种抑制的确切机制仍不清楚。本研究重点研究基于TPP的化合物SkQ1和C 12 TPP对MC脱颗粒过程中Fc ε RI依赖性线粒体功能障碍和信号传导的影响。主要方法：用抗二硝基苯基IgE致敏MC，并用BSA偶联的二硝基苯基刺激MC。通过β-己糖胺酶释放来估计MC的脱颗粒。通过对接头分子LAT、激酶Syk、PI3K、Erk1/2和p38的Western印迹分析确定基于TPP的化合物对Fc ε RI依赖性信号传导的影响。荧光显微镜用于评估线粒体参数，例如形态、膜电位、活性氧和 ATP 水平。主要发现：用基于 TPP 的化合物进行预处理可显著降低 Fc ε RI 依赖的 MC 脱颗粒。基于 TPP 的化合物还可以防止线粒体功能障碍（线粒体 ATP 水平下降和线粒体裂变），并降低 Erk1/2 激酶磷酸化。U0126 选择性抑制 Erk1/2 还可以减少 β -己糖胺酶释放并防止 Fc ε RI 依赖的 MC 脱颗粒期间的线粒体碎裂。意义：这些发现扩展了对线粒体在 MC 激活中的作用的基本理解。它还为开发用于治疗过敏性疾病的线粒体靶向药物提供了理论依据。
双特异性抗体靶向脂质纳米粒子 Angelo ...
摘要脂质纳米颗粒 (LNP) 是临床上最先进的非病毒基因传递系统。虽然在增强传递方面取得了进展，但细胞特异性靶向仍然是一个挑战。靶向部分（例如抗体）可以化学结合到 LNP 上，但是，这种方法很复杂，并且在扩大规模方面面临挑战。在这里，我们开发了一种生成抗体结合 LNP 的方法，该方法利用双特异性抗体 (bsAb) 作为靶向桥。作为 bsAb 的对接位点，我们生成了具有短表位的 LNP，该表位源自血凝素抗原 (HA)，嵌入颗粒的 PEG 成分 (LNP HA )。我们生成了 bsAb，其中一个域结合 HA，另一个域结合不同的细胞表面蛋白，包括 PD-L1、CD4、CD5 和 SunTag。bsAb 和 LNP 的非化学结合大大提高了表达同源靶标的细胞的转染效率和特异性。 LNP/bsAb 介导体内转染 PD-L1 表达癌细胞的几率增加 4 倍，体外转染静止原代人 T 细胞的几率增加 26 倍。此外，我们还创建了一种通用 bsAb，可识别 HA 和抗大鼠 IgG2，使 LNP 能够与现成的抗体（如 CD4、CD8、CD20、CD45 和 CD3）结合。通过利用分子对接和 bsAb 技术，这些研究展示了一种简单有效的策略来生成抗体偶联的 LNP，从而实现精确高效的 mRNA 递送。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，葡萄糖稳态和糖尿病相关的内皮细胞功能障碍
摘要：由于活性氧（ROS）的过量产生，血管内皮内的氧化应激被认为是2型糖尿病的心脏血管并发症的起始和进展至关重要的。ROS一词包括多种化学物种，包括超氧化阴离子（O 2• - ），羟基自由基（OH - ）和过氧化氢（H 2 O 2）。虽然低浓度ROS的本构生成对于正常的细胞功能是必不可少的，但过量的O 2• - 可能导致不可逆的组织损伤。过量的ROS产生由黄嘌呤氧化酶，未偶联的一氧化氮合酶，线粒体电子传输链和烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶催化。在O 2• - - NADPH氧化酶的NOX2同工型中被认为对2型糖尿病中发现的氧化应激至关重要。 相比之下，转录调控的NOX4同工型产生H 2 O 2，可以发挥保护作用，并有助于正常的葡萄糖稳态。 本综述描述了NOX2和NOX4的关键作用，以及NOX1和NOX5在葡萄糖稳态，内皮功能和氧化应激中的关键作用，其关键重点侧重于它们在健康中的调节，并且在2型糖尿病中的调节失调。被认为对2型糖尿病中发现的氧化应激至关重要。相比之下，转录调控的NOX4同工型产生H 2 O 2，可以发挥保护作用，并有助于正常的葡萄糖稳态。本综述描述了NOX2和NOX4的关键作用，以及NOX1和NOX5在葡萄糖稳态，内皮功能和氧化应激中的关键作用，其关键重点侧重于它们在健康中的调节，并且在2型糖尿病中的调节失调。
建立合成的正交复制系统可以在大肠杆菌中加速进化
生物中新功能的发展是人群中连续基因组突变和选择的结果。这个过程很慢，进化速率从根本上受到临界突变率（1）的限制。divienced的进化通常通过体外产生遗传多样性来避开体内突变率的限制（2），但这并不能使生物体内基因的持续演变。细胞的突变率可以瞬时增加，但是高水平的未靶向突变会导致基因组上的灾难性突变负荷，并且是不可持续的。插入病毒基因组中的基因可以通过迭代感染新的诱变细胞来突变（3-6）。这种方法避免了增加细胞基因突变速率的挑战，并且可以扩展以选择某些表型（7）。然而，该策略仅限于不断发展的基因，这些基因足够小，可以包装到病毒中，并选择可以与感染性偶联的表型。此外，在复制应激条件下的细胞中进行选择，这可能会进一步限制可以探索的细胞表型。将突变直接引导到细胞内特定的，有针对性的DNA序列而没有实质上增加基因组突变率的策略提供了驱动靶序列加速，可持续，连续，连续的细胞演化的可能性（8-17）。通过将靶基因重组到酵母中现有的线性质粒系统开创性的工作利用了现有的天然线性质粒，该质粒在酵母菌溶胶中起作用，并由专用的，蛋白质的DNA聚合酶复制，该聚合酶不将酵母基因组复制为天然正交复制系统（12，13）。
TR-CRP-001使用说明-AAZ
crp acm®通过视觉解释测试条的颜色强度来实现对CRP浓度的半定量检测。抗CRP抗体被固定在硝酸纤维素膜的测试区域上。与胶体金标记颗粒偶联的抗CRP抗体用作冻干的偶联物。在测试过程中，用户收集的整个血液样本沿缓冲液拖动，然后沿硝酸纤维素膜迁移。如果测试的样品包含CRP，则与染色的缀合物结合。这样形成的复合物迁移到膜上到测试线（t），在该测试线将被附着在膜上的抗CRP抗体捕获。彩色测试线将出现在“结果”窗口（t）中。T线的强度取决于样品中CRP的浓度。没有测试线（T）表示正常的CRP水平（小于10mg/L）。测试线（t）的强度低于参考线（r）的强度，表明样品中的CRP水平在10至40 mg/l之间。测试线强度（t）高于参考线（R）的测试线强度（t），低于控制线（c）的测试线强度（t）表示样品中的CRP水平在40至100 mg/l之间。测试线（T）的强度高于控制线（C）的强度（c）表示样品中的CRP水平大于100 mg/l。在控制线（C）处的彩色带的外观用作程序检查，表明已添加了正确的样品体积，并且膜已被邪恶。
精确而快速的溶剂辅助几何蛋白自我...
功能蛋白与微透明剂的精确和高分辨率耦合对于制造微型生物电子设备至关重要。此外，微电极的电化学对电化学分析和传感器技术产生了重大影响，因为微电极的尺寸较小会影响分析物的径向扩散通量，从而提供了增强的质量传输和电极动力学。然而，与这种微电子相关的工艺技术与通常使用的召集生物结合技术之间存在了巨大的技术差距。在这里，我们使用溶剂辅助的蛋白质 - 麦克塞尔吸附印刷（GPS）进行了高分辨率和快速的几何蛋白自我图案（GPS）方法，以将夫作生物分子送到微电源上，以最小特征大小为5μm，并且打印时间约为一分钟。GPS方法用于微观的多种生物分子，包括酶，抗体和抗生物素生物素化的蛋白质，可提供良好的几何比对并保留生物学功能。我们进一步证明，用于葡萄糖检测的酶偶联的微电极表现出良好的电化学性能，从GPS方法中受益，可以最大程度地提高生物接口处有效的信号转导。这些微电极阵列保持了快速收敛分析物扩散，显示典型的稳态I - V特性，快速响应时间，良好的线性灵敏度（0.103 Na mm-2 mm-2 mm-1，r 2 = 0.995）和超宽线性动态范围（2 - 100 mm）。我们的发现为生物分子与微电体阵列的精确耦合提供了一种新的技术解决方案，对诊断，生物燃料细胞和生物电机设备的规模和生产具有重要意义，这些设备无法经济地实现其他现有技术。
弹性蛋白靶向纳米粒子递送强力霉素可缓解细胞因子风暴并减少 LPS 介导的肺部炎症中的免疫细胞浸润
气道重塑是急性和慢性肺部疾病（如急性病毒感染，包括 SARS-CoV-2 和肺气肿）最明显的后果，它是呼吸系统结构成分中促炎性细胞内和细胞外事件的后遗症 [1,2]。这些气道疾病导致上皮细胞凋亡和炎性细胞浸润。所有这些病理事件均导致或由肺泡弹性蛋白损伤所致，而肺泡弹性蛋白是呼吸力学的重要组成部分，负责肺弹性回缩。促炎性细胞因子 IL-6、IL-1 β、TNF- α、IL-23 和蛋白酶 MMPs 2、9 和 12 是肺部炎症相关变化的常见调控因子 [3]。它们已被证实可以降低弹性蛋白 mRNA 表达或直接降解肺中的弹性蛋白。这些细胞因子目前不仅是 COPD 药物研发的主要靶点，也是肺部病毒感染引起急性肺损伤的主要靶点。FDA 已批准两类 IL-6 抑制剂用于治疗 COVID 19，即 a) 抗 IL-6 受体单克隆抗体 (mAb)（例如 sarilumab、tocilizumab）和 b) 抗 IL-6 mAb（即 siltuximab）。FDA 最近于 2022 年 12 月 21 日批准托珠单抗与地塞米松一起用于 COVID 19 患者作为辅助疗法，而 Sarilumab 尚未被批准用于细胞因子风暴管理 [4]。然而，这些药物有严重的副作用，包括中性粒细胞减少症、低纤维蛋白原血症和增加继发感染的风险，如结核病、细菌和真菌感染以及碗穿孔，限制了它们在一般健康人群中的使用 [5]。强力霉素 (Doxy) 已被发现在许多情况下是一种有用的药物。最近的一份报告显示，用 Doxy 治疗 Vero E6 细胞前后均能以剂量依赖性方式有效抑制 SARS-CoV-2 毒株 (IHUMI-3) [6]。Doxy 的抗炎潜力被用于治疗慢性疾病，包括布鲁氏菌病性脊柱炎、创伤性脑损伤、腹主动脉瘤，其中它已被证明可以降低全身炎症标志物 IL-6 的水平，并抑制 MCP-1 和 MMP 等趋化因子 [7-10]。相反，Butler 等人最近的一项研究表明，用强力霉素（口服）治疗并不能减少 COVID-19 相关的康复时间以及死亡人数 [11]。然而，这是系统性地给予一种首过代谢损失很大的药物，因此可能无法在局部肺组织中达到高浓度。此前，我们已经证明单次静脉注射注射弹性蛋白抗体偶联的载有强力霉素的牛血清白蛋白纳米颗粒 (Doxy NP) 可有效靶向肺气肿，并导致强力霉素在四周内局部持续释放到肺部，与强力霉素 IV 相比，导致基质金属蛋白酶 (MMP) 活性降低 [ 12 ]。我们的方法是当纳米颗粒进入肺部弹性蛋白损伤部位时将强力霉素输送到肺部，因此，少量药物比全身剂量更有效。我们并不是说这种疗法可以恢复 COVID 患者的肺部，而是强调靶向给药比全身给药更好。 Doxy 的作用部分在于抑制蛋白激酶 B (AKT) 信号通路和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPKs) 信号蛋白，包括体外 VSMC 中的细胞外信号调节激酶 (ERK)、c-Jun 氨基末端激酶 (JNK) [ 5 ]。其炎症小体抑制能力被发现有利于改变前列腺癌 (PC3) 和肺癌细胞系 (A549) 中的肿瘤微环境 [ 13 ]。然而，目前尚不清楚 Doxy 如何抑制炎症反应，特别是在肺部。我们想测试 Flexibzumab 偶联的载有强力霉素的牛血清白蛋白纳米颗粒的静脉输送是否
EGFR 靶向可电离脂质纳米粒子增强体内 mRNA 向胎盘的递送
由于可电离脂质纳米粒子 (LNP) 在全身给药后主要在肝脏中积累，因此其作为体内核酸递送平台的全部潜力尚未实现，这限制了它们在以肝脏为中心的条件下的成功。用抗体靶向部分对 LNP 进行工程设计可以通过促进位点特异性 LNP 束缚并通过受体介导的内吞作用驱动 LNP 优先吸收到受体表达细胞类型中来实现肝外趋向性。源于胎盘功能障碍的产科疾病，例如先兆子痫，其特征是细胞受体过度表达，包括表皮生长因子受体 (EGFR)，这使得靶向 LNP 平台成为妊娠期间胎盘功能障碍的一种令人兴奋的潜在治疗策略。在此，通过对 LNP 进行工程设计，增加抗体功能化的密度，开发了一种 EGFR 抗体偶联的 LNP (aEGFR-LNP) 平台。在永生化胎盘滋养层细胞中体外筛选了 aEGFR- LNP，并在非妊娠和妊娠小鼠体内进行了筛选，并与非靶向配方进行了比较，以将抗体靶向的 mRNA LNP 递送至胎盘。与非靶向对应物相比，我们表现最佳的 LNP 具有中等密度的抗体功能化（1:5 aEGFR-LNP），可介导小鼠胎盘中 mRNA 递送量增加约两倍，EGFR 表达滋养层细胞中 LNP 摄取量增加约两倍。这些结果证明了抗体偶联 LNP 实现肝外向性的潜力，以及 aEGFR-LNP 促进 mRNA 递送至胎盘中 EGFR 表达细胞类型的能力。