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A39097096 Collibri™ ES DNA 文库制备试剂盒（含 PCR MM）包装批号：2818863 有效期：2024 年 9 月 30 日（DD.MM.YYYY）储存温度：-20±5°C
批次 数量 描述 2791569 2 x 1.25 mL 2x Platinum™ SuperFi™ 文库扩增预混液 2806274 500 µL 10x 片段化和 dA 加尾缓冲液 2805059 1 mL 5x 片段化和 dA 加尾酶混合物 2806270 1 mL 7x 连接预混液 2803108 2 x 500 µL 引物混合物
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环
USP mRNA 疫苗章节
几十年来，人们一直在探索利用信使核糖核酸 (mRNA) 技术来研发流感、寨卡病毒、狂犬病和巨细胞病毒等传染病的疫苗。COVID-19 疫情加速了该技术作为疫苗平台的研究和开发，导致 mRNA 疫苗成为美国首个获得紧急使用授权并随后获批用于 SARS-CoV-2 的疫苗。用于预防 COVID-19 的 mRNA 疫苗已被证明是该技术的成功应用，然而，对于检测这些疫苗质量属性的指导仍然有限。一套标准的分析方法将为世界各地的疫苗开发商、制造商、监管机构和国家控制实验室提供支持，通过提供工具来帮助加速使用该平台开发安全有效的疫苗，并防止出现劣质和伪造的疫苗产品。根据各利益相关方确定的这一需求，USP 和我们的 BIO3 专家委员会制定了 mRNA 疫苗的通用章节草案，作为制定 mRNA 疫苗测试程序章节的第一步。本章节包括分析程序和最佳实践，以支持对 mRNA 疫苗的共同质量属性进行评估。本章节草案还以一般章节<1235>《人用疫苗——一般考虑因素》和<1239>《人用疫苗——病毒疫苗》中描述的最佳实践为基础。章节草案中的方法改编自公开来源，尚未经过 USP 的核实或确认。USP 和我们的 BIO3 专家委员会将提前发布章节草案以征求公众意见。通过提前发布，USP 希望征求利益相关者对参考文件中描述的方法的反馈，并鼓励提交与章节草案中提出的方法相关的任何替代方法和任何其他支持文件，包括验证文件。引言天然存在的 mRNA 是在真核细胞中通过 RNA 聚合酶转录细胞核中的 DNA 来产生的。 mRNA 分子从细胞核运输到细胞质，在那里它们作为模板，由核糖体翻译产生特定的蛋白质。通过这种方式，储存在细胞核中的信息被用来产生特定的蛋白质。这种 mRNA 不能产生除其编码的蛋白质以外的任何蛋白质。注射后，mRNA 的估计半衰期约为 8-10 小时，之后它会迅速降解并被体内的天然 RNase 分解。mRNA 不需要进入细胞核即可发挥作用。通常，可以通过在宿主（例如大肠杆菌）中扩增起始 DNA 质粒来制备 mRNA 疫苗药物物质。质粒在用于大规模生产 mRNA 中间体之前，需要进行酶线性化和纯化。在无细胞系统中，通过体外转录从线性化质粒 DNA 模板中产生 mRNA。根据具体的制造工艺，构建体用核苷优化以形成序列，转录的 mRNA 在 7-甲基鸟苷的 5' 端酶促加帽和/或在 3' 端用 poly (A) 酶促加尾。然后纯化 mRNA 药物物质并配制成药物产品。mRNA 疫苗药物产品可以是嵌入脂质纳米颗粒 (LNP) 中的 mRNA 制剂。LNP 保护 mRNA 免于降解并帮助 mRNA 通过内吞作用进入细胞。一旦进入内体，mRNA 疫苗分子就会逃离内体进入细胞质（取决于可电离脂质和 mRNA 核苷酸的摩尔比）并提供模板以产生多个病毒蛋白拷贝。病毒蛋白作为抗原刺激免疫反应，这是疫苗接种的预期结果。目前已开发出两种主要形式的 mRNA 疫苗：非复制型 mRNA 疫苗（常规）和自扩增型 mRNA (SAM) 疫苗，如下图 1 所示。常规非复制型 mRNA 疫苗构建体通常由 5′ 7-甲基鸟苷帽结构、5′ 非翻译区 (UTR)、编码蛋白质的开放阅读框 (ORF)、3′ UTR 和 3′ poly(A) 尾组成。SAM mRNA 疫苗源自 alpha 病毒基因组，其中 mRNA 分子编码可指导细胞内 mRNA 扩增的其他复制酶成分。在这两种形式的 mRNA 疫苗中，UTR 区域对于最大化蛋白质表达、mRNA 分子的 5′ 加帽、阻断核酸外切酶介导的降解和提高翻译效率都很重要。UTR、5' 帽和 poly(A) 尾也有助于稳定非复制型 mRNA 疫苗（常规）和自扩增型 mRNA (SAM) 疫苗，如下图 1 所示。常规非复制型 mRNA 疫苗构建体通常由 5′ 7-甲基鸟苷帽结构、5′ 非翻译区 (UTR)、编码蛋白质的开放阅读框 (ORF)、3′ UTR 和 3′ poly(A) 尾组成。SAM mRNA 疫苗源自 alpha 病毒基因组，其中 mRNA 分子编码可指导细胞内 mRNA 扩增的其他复制酶成分。在这两种形式的 mRNA 疫苗中，UTR 区域对于最大化蛋白质表达、mRNA 分子的 5′ 加帽、阻断核酸外切酶介导的降解和提高翻译效率都很重要。UTR、5' 帽和 poly(A) 尾也有助于稳定非复制型 mRNA 疫苗（常规）和自扩增型 mRNA (SAM) 疫苗，如下图 1 所示。常规非复制型 mRNA 疫苗构建体通常由 5′ 7-甲基鸟苷帽结构、5′ 非翻译区 (UTR)、编码蛋白质的开放阅读框 (ORF)、3′ UTR 和 3′ poly(A) 尾组成。SAM mRNA 疫苗源自 alpha 病毒基因组，其中 mRNA 分子编码可指导细胞内 mRNA 扩增的其他复制酶成分。在这两种形式的 mRNA 疫苗中，UTR 区域对于最大化蛋白质表达、mRNA 分子的 5′ 加帽、阻断核酸外切酶介导的降解和提高翻译效率都很重要。UTR、5' 帽和 poly(A) 尾也有助于稳定