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利用 CRISPR/Cas9 改造的麦胶蛋白基因家族
摘要：小麦的 α -麦胶蛋白与其他面筋成分一起决定了面包的粘弹性。然而，它们也与人类病理有关，如乳糜泻或非乳糜泻小麦敏感性。CRISPR/Cas 已成功用于敲除面包小麦和硬粒小麦中的 α -麦胶蛋白基因，从而获得低筋小麦品系。尽管如此，这些基因的突变分析很复杂，因为它们在 A、B 和 D 亚基因组中呈现多个高度同源的拷贝串联排列。在这项工作中，我们提出了一种基于 NGS 扩增子测序的生物信息学流程，用于分析两个单向导 RNA (sgRNA) 靶向的 α -麦胶蛋白基因中的插入和缺失 (InDels)。通过与最相似的野生型亲本序列进行比较，该方法可以识别突变的扩增子并分析 InDels。对样本间比较进行了 TMM 标准化；能够研究各代中每个 InDel 的丰度，并观察 Cas9 编码序列在不同细胞系中分离的影响。该工作流程的实用性与识别可能的基因组重排（例如由于 Cas9 切割活性而导致的大量缺失）有关。该流程能够快速表征多拷贝基因家族中多个样本的突变。
分支特异性基因和新颖性的进化起源
摘要 分支特异性（又称谱系特异性）基因非常常见，存在于所有分类学水平和所有被研究的分支中。它们可以通过复制先前存在的基因而产生，这可能涉及部分截断或与其他蛋白质结构域或调控序列的组合。它们也可以从非编码序列重新进化，从而产生潜在的真正新颖的蛋白质结构域。最后，由于分支特异性基因通常被定义为与其他蛋白质缺乏序列同源性，因此它们也可以通过足够快的序列进化而产生，以至于先前的序列同源性不再被检测到。在这种情况下，快速进化之后是限制，我们认为它们在本体论上是非新颖的，但在功能层面上可能是新颖的。一般来说，分支特异性基因较少受到生物学家的关注，但它们在重要性状中的作用的有趣例子越来越多。在这里，我们回顾了一些最近选定的例子，并认为对分支特异性基因的关注是对进化发育动物领域习惯的保守发育调控工具包的关注的重要纠正。最后，我们讨论了有关分支特异性基因进化的问题，以及未来研究如何解决这些问题。我们强调了这样的假设：与其他基因相比，分支特异性基因更有可能参与它们出现的主干群中出现的共衍生征。
bsgatlas：统一的枯草芽孢杆菌基因组和转录组注释图集，具有增强的信息访问
2020年7月29日收到； 2021年1月11日接受；于2021年2月4日出版：作者隶属关系：1个非编码RNA技术与健康中心，哥本哈根大学兽医和动物科学系，1871年，丹麦Frederiksberg，哥本哈根大学； 2荷兰荷兰癌症研究所的致癌基因组学司，荷兰阿姆斯特丹1066； 3哥本哈根大学生物学系计算和RNA生物学部分，丹麦哥本哈根1165；丹麦的Bagsværd4 Novozymes。*通信：Jan Gorodkin，Gorodkin@rth。DK关键字：B。uttilis;基因组注释；非编码和结构化RNA；操纵子。缩写：Asrna，反义RNA； CD，编码序列；去，基因本体论； GRNA，导向RNA； Ji，Jaccard索引； ncRNA，非编码RNA； SRNA，小RNA； TMRNA，转移Messenger RNA； TSS，转录开始站点； TTS，转录终止位点； TU，转录单元； UTR，未翻译区域。†目前地址：英国索尔福德大学科学，工程与环境学院。数据语句：文章或通过补充数据文件中提供了所有支持数据，代码和协议。本文的在线版本可以使用四个补充表和九个补充数据。000524©2021作者
可用的EST-SSR标记的功能特性... div>
摘要。源自的简单序列重复标记（EST-SSR）是研究遗传多样性，系统发育，进化，比较基因组学，QTL分析和基于基因关联的重要工具。我们已经搜索了用于苏格兰松树的已知EST-SSR（Pinus sylvestris l。）- 世界上主要的森林物种之一。然后，在102个EST-SSR中，有91个建议用于苏格兰松树研究，并与Pinus taeda L.的参考基因组以及Sylvestris的可用基因进行了对齐。通过保守域分析（CDD），基因本体学注释的已知同源物的功能分析以及KEGG途径分析，通过保守的域分析（CDD），基因组位置和相关基因的共识功能进行了共识。许多标记都位于未翻译的区域（主要是3'UTR），以及苏格兰和斑驳的松树基因的编码序列。对于八个标记，其序列已知的序列在任何一个物种中都无法识别基因。这些标记中的七个位于当前基因组组件中没有基因的塔达疟原虫支架区域（v.1.0）。将来可以使用结果来改善人群遗传研究的标记，自适应特征的研究和sylvestris的QTL映射以及其他松树物种。关键词：EST-SSR，Pinus Sylvestris，Marker-Gene关联，标记基因组位置，功能注释。
NDP 外显子 2 区域 KO 报告模板...
图 S01：CRISPR/Cas9 编辑人类 iPSC。(A) 使用双 sgRNA（sg1 和 sg2）靶向外显子 2 两侧的区域来生成 HDR 介导的 NDP KO-GFP 报告系，使用带有 KO 报告模板的 PUC57 载体，由外显子 2 (5'UTR)-eGFP-P2A 盒组成，两侧是同源臂 (HA)，其中包括 PAM 位点突变和用于质粒线性化的 sgRNA 切割位点 (sg1-c 和 sg2-c)。在此过程中还生成了 NHEJ 介导的 NDP KO (NDP Δ exon2) 以及 NDP WT 同源克隆。(B) 使用类似方法生成 NDP WT-GFP 报告系。外显子 3 的 CDS 两侧的双 sgRNA（sg3 和 sg4）和含有修复模板的质粒，由外显子 3（CDS）-V5-P2A- eGFP 盒组成，两侧是同源臂，包括 PAM 位点突变和用于质粒线性化的 sgRNA 切割位点（sg3-c 和 sg4-c）。sgRNA，小向导 RNA；HDR，同源定向修复；KO-GFP，敲除报告基因；KO，敲除；WT，野生型；PAM，protoscpacer 相邻基序；UTR，非翻译区；CDS，编码序列；HA，同源臂；eGFP，增强型绿色荧光蛋白；P2A，猪 teschovirus-1 2A 自切割肽；V5，V5 标签。
治疗朊病毒病的二价 siRNA
药物降低 PrP 表达对动物模型中的朊病毒病有效，目前正在进行临床测试。将 PrP 降低 50% 可延长感染朊病毒的小鼠的生存时间和健康寿命，但不能防止症状出现或阻止疾病进展。其他候选药物应寻求将 PrP 表达降低到更低的水平。二价 siRNA 是一种新型寡核苷酸药物模式，在临床前模型中具有良好的效力、耐用性和生物分布数据，这激励我们在这项技术中寻找治疗朊病毒病的新药物候选物。在这里，我们首先确定一种针对小鼠 PrP 基因的工具化合物，并确定降低 PrP 的二价 siRNA 在感染朊病毒的小鼠中的功效。然后，我们引入了含有人类 PrP 基因完整非编码序列的人源化转基因小鼠系作为识别人类序列靶向药物的工具。我们鉴定出一种针对人类 PrP 基因的高效 siRNA 序列，并确定一种包含延伸核酸和与 RNA 靶标不匹配的 3′ 反义尾的化学支架可产生更佳的效力。我们提名降低 PrP 的二价 siRNA 2439-s4 作为人类朊病毒病的新候选药物。
毛果杨体外转化的全基因组关联研究和网络分析支持多种植物激素途径和串扰的关键作用
许多植物物种和基因型对转化和再生 (TR) 的适应性存在很大差异，这对基因工程在研究和育种中的应用提出了挑战。为了帮助了解这种变异的原因，我们使用 1204 棵野生黑杨树种群进行了关联作图和网络分析。为了对愈伤组织和嫩枝 TR 进行精确和高通量的表型分析，我们开发了一种计算机视觉系统，可以交叉引用互补的红、绿、蓝 (RGB) 和荧光高光谱图像。我们使用单标记和组合变异方法进行了关联作图，然后对已发表的多组学数据集进行了上位性和整合的统计检验，以确定可能的调控中心。我们报告了 409 个与编码序列 5 kb 范围内的关联有关的候选基因，上位性测试表明其中 81 个候选基因是彼此的调节因子。与蛋白质 - 蛋白质相互作用和转录调控相关的基因本体术语被过度使用。除了长期确定对 TR 至关重要的生长素和细胞分裂素通路之外，我们的结果还强调了应激和伤害通路的重要性。这些通路内和跨通路的潜在信号调节中心包括生长调节因子 1 (GRF1)、磷脂酰肌醇 4-激酶 β 1 (PI-4K β 1) 和 OBF 结合蛋白 1 (OBP1)。
随着哺乳动物的大脑尺寸和皮质折叠而进化
摘要 在哺乳动物进化的过程中，大脑尺寸和皮质折叠反复增加和减少。识别与这些性状共同进化的遗传元素，其序列或功能特性可为进化和发育机制提供独特信息。TRNP1 是这种比较方法的一个很好的候选者，因为它控制着小鼠和雪貂神经祖细胞的增殖。在这里，我们研究了 TRNP1 的调控序列和编码序列对 30 多种哺乳动物大脑尺寸和皮质折叠的贡献。我们发现 TRNP1 蛋白质进化的速度 ( ω ) 与大脑尺寸显著相关，与皮质折叠的相关性略低，与身体尺寸的相关性小得多。这种大脑相关性比 95% 以上的随机对照蛋白更强。这种共同进化可能影响 TRNP1 活性，因为我们发现来自大脑较大和皮质折叠较多物种的 TRNP1 会诱导神经干细胞的更高增殖率。此外，我们在大规模并行报告基因测定中比较了 TRNP1 的假定顺式调控元件 (CRE) 的活性，并确定了一种可能与旧世界猴和猿类的皮质折叠共同进化的 CRE。我们的分析表明，增加 TRNP1 活性的编码和调控变化被积极地选择为脑容量和皮质折叠增加的原因或结果。它们还提供了一个示例，说明系统发育方法如何为生物机制提供信息，尤其是当与多个物种的分子表型相结合时。
一种基于荧光的新型基因编辑分子筛选方法，用于治疗连接性大疱性表皮松解症
摘要：连接性大疱性表皮松解症 (JEB) 是一种严重的起泡性皮肤病，由编码皮肤完整性所必需的结构蛋白的基因突变引起。在本研究中，我们开发了一种适用于研究 JEB 相关 COL17A1 基因表达的细胞系，该基因编码 XVII 型胶原蛋白 (C17)，C17 是一种跨膜蛋白，参与连接基底角质形成细胞和皮肤下层真皮。利用化脓性链球菌的 CRISPR/Cas9 系统，我们将 GFP 的编码序列与 COL17A1 融合，导致 GFP-C17 融合蛋白在人类野生型和 JEB 角质形成细胞中在内源性启动子的控制下组成性表达。我们通过荧光显微镜和蛋白质印迹分析证实了 GFP-C17 的准确全长表达和定位到质膜。正如预期的那样，GFP-C17 mut 融合蛋白在 JEB 角质形成细胞中的表达未产生特定的 GFP 信号。然而，在表达 GFP-COL17A1 mut 的 JEB 细胞中，CRISPR/Cas9 介导的 JEB 相关移码突变修复导致 GFP-C17 恢复，这在融合蛋白的全长表达、其在角质形成细胞单层质膜内以及 3D 皮肤等效物的基底膜区内的准确定位中显而易见。因此，这种基于荧光的 JEB 细胞系有可能作为筛选个性化基因编辑分子和体外应用以及在适当的动物模型中体内应用的平台。
蛋白质工程方法增强酿酒酵母真菌漆酶的产量
摘要：腐生担子菌分泌的漆酶是一种多功能生物催化剂，仅需氧气即可氧化多种芳香族化合物。酿酒酵母是真菌漆酶工程的首选宿主。为了帮助酵母分泌活性酶，天然信号肽通常被酿酒酵母α交配因子（MF α 1）的前原前导序列取代。然而，在大多数情况下，只能获得基础酶水平。在酿酒酵母中与α因子前原前导序列融合的漆酶的定向进化过程中，我们证明了信号肽中积累的突变显著提高了酶的分泌。在这里，我们描述了为增强在酿酒酵母培养物液体提取物中检测到的漆酶活性而实施的不同蛋白质工程方法。我们通过使用实验室中连续进行的漆酶进化活动获得的适应性最强的突变 α 因子前导序列，证明了天然和工程漆酶的分泌得到改善。我们还特别关注了蛋白质 N-糖基化在漆酶生产和特性中的作用，以及通过共识设计引入保守氨基酸，从而能够表达酵母原本不会产生的某些漆酶。最后，我们修改了在之前的定向进化活动中积累的漆酶编码序列 (CDS) 突变的贡献，这些突变促进了酶的生产。