照射后C-Au-PFH-NPs组荧光信号分布与照射前相比均有明显改善。除肝脏和脾脏外,两组主要脏器荧光信号分布均无明显改变(图5B和C)。非靶向组肿瘤部位荧光信号较低可能是由于EPR效应,促使肿瘤组织中发生惰性结合。相比之下,靶向组荧光信号的改善主要归因于C225介导的内吞机制。此外,C-Au-PFH-NPs可以突破肿瘤的生物屏障。微泡振荡、空化和破坏后,C-Au-PFH-NPs在目标部位的聚集得到证实。在超声靶向去除微泡的影响下,声微泡振荡和破碎过程中,细胞膜会被打断,其通透性会降低。
摘要。表达标记蛋白的稳定细胞系和动物模型是研究细胞和分子行为的重要工具。已经应用了几种分子生物学技术来建立表达标记蛋白的细胞系,并取得了不同程度的成功和效率。在这里,我们应用 CRISPR/Cas9 将标记蛋白敲入内源基因位点的 5'UTR。通过这种 5'UTR 靶向敲入策略,建立了表达 Arl13b-Venus、Reep6-HA 和 EGFP-alpha-tubulin 的稳定细胞系,在抗生素选择的细胞中效率高达 50% 至 80%。敲入蛋白的定位与野生型细胞中内源蛋白的定位相同,并表现出均质表达。此外,从内源启动子敲入的 EGFP-alpha-tubulin 的表达在长期培养中是稳定的。我们进一步证明荧光信号足以进行长时间延时成像。在整个延时成像过程中,荧光信号清晰可见,并显示出特定的亚细胞定位。总之,我们的策略表明 5'UTR 是生成细胞系的合适位点,用于在哺乳动物细胞中稳定表达来自内源位点的标记蛋白。
SMLM可以进一步分为三个主要家族,具体取决于单个荧光分子分离的机制:(i)基于光激活/开关显微镜,包括光激活的定位显微镜(PALM),Sto-Chastic光学光学重建显微镜(Storm),Direct Storm(Distorm); (ii)动态标记显微镜,包括基于可逆结合的纳米级地形(油漆)成像的点积累,以及(iii)荧光终身分离显微镜。所有这些方法,基于不同的分离方法,都具有自己的优势,并且在生物学和材料科学方面都有用,如其他地方彻底综述。5–11中,由于各种样品中动态标记的实用性,油漆正在增长。从这个角度来看,我们旨在在油漆显微镜下对探针设计中的最新状态提供见解,并将工具箱扩展到DNA之外,以探针为探针。油漆的概念是基于以下前提:荧光探针旨在使用溶液自由地差异分子(图1,中间面板)。与目标结合后,它们被固定,并且单分子的荧光信号出现在摄像机上,可以通过拟合程序定位。作为探针的动力学确保解开,荧光信号再次旋转,直到新分子结合。随着探针的连续补充,它对光漂白不敏感,这是该方法的主要优势,而不是其他SMLM技术。这允许长时间的成像时间,从而具有更高的精度。此外,通过将多个探针与不同的染料相结合,
在波士顿大学(BU)攻读生物医学工程博士学位时,她的研究重点是开发高度敏感和多重的过敏诊断平台。她设计了分层的底物设计,以校准和增强微阵列中的荧光信号,开发了基于蛋白质的光学生物传感器,以在复杂的生物流体中运行,LED并撰写了成功的赠款应用,并与BU技术开发办公室紧密合作。Margo还拥有材料科学,工程和音乐表演的学士学位。在大学期间,Margo致力于改善医疗设备的表面生物相容性。
HK-CRISPR-CAP-H-MEGFP细胞系是一种为晚期基因编辑和荧光应用而设计的人类衍生模型。该细胞系基于亲本人类细胞系,并已使用CRISPR-CAS9技术进行了修改,以表达用单体增强的绿色荧光蛋白(MEGFP)标记的CAP-H(染色体相关蛋白H)基因。这种修饰允许CAP-H的精确可视化和跟踪,CAP-H是冷凝蛋白复合物的组成部分,对于细胞分裂期间的染色体凝结和稳定至关重要。MEGFP标签提供了强烈而稳定的荧光信号,这使该细胞系非常适合活细胞成像和基于荧光的测定。
该试剂盒非常适合定量 RNA,用于下一代测序 (NGS) 或逆转录 PCR (RT-PCR) 等敏感应用。与基于吸光度的测量不同,RNA Broad Range Dye 对 RNA 的选择性高于双链 DNA (dsDNA),并且可以耐受样品中等摩尔量的 dsDNA,而不会对 RNA 定量产生显著影响(图 4)。仍然建议使用纯化的 RNA 样品。该测定还可用于定量小 RNA,例如 miRNA(图 5)以及单链 DNA (ssDNA),尽管与 RNA 相比,ssDNA 发出的荧光信号较低(图 6)。与总 RNA 相比,该测定对 dsRNA 发出的信号非常低(图 7)。
图 1. 数字 PCR 工作流程概述。对于 QuantStudio Absolute Q 系统,dPCR 反应混合物的制备与 qPCR 反应混合物的制备几乎相同。dPCR 和 qPCR 之间的两个主要区别是:(i) 将批量反应混合物分离成数千个单独的微反应,以及 (ii) 基于终点的检测,将微反应分类为目标的阳性或阴性,从而通过应用泊松统计实现直接目标量化。对于 QuantStudio Absolute Q 系统,仪器会自动将反应混合物分离到微室中,进行热循环并收集荧光信号,所有步骤之间都无需用户干预。
纳米杆技术使用生物发光共振能量转移(BRET)研究活细胞中蛋白质蛋白质的相互作用。研究了成人骨形成的调节剂Schnurri-3的相互作用,与ERK-2使用了2个不同的载体。一个载体包含Schnurri-3和Nanoluc®,一种具有高效率生成光子的发光酶,第二个载体包含ERK-2 PlusHalotag®,荧光配体。当两种蛋白质接近近距离时,观察到荧光。确定了Schnurri-3-ERK相互作用抑制剂的纳米伯特分析以及纳米信号与荧光信号的比率。使用MEK在竞争相互作用的单元格中验证了这一点,如果过表达,则会降低荧光信号。
将小鼠分组(n=4),在右后腿肌肉注射HBsAg、HBsAg/Al或HBsAg/HPLNP(w/w=1/600)制剂,剂量为1 µg HBsAg/只小鼠。肌肉注射后,在12、24、48和72小时通过体内成像系统FX Pro(Kodak)采集注射部位的荧光图。在不同时间点获得各组小鼠注射部位的平均荧光强度图。肌肉注射后,在12、24、48和72小时采集肠系膜淋巴结的荧光信号。计算不同组别的注射部位和肠系膜淋巴结的平均荧光强度,以比较各种疫苗制剂在抗原储存效应和淋巴结引流方面的效果。2.9 淋巴结中淋巴细胞的激活