目录 简介……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………3 组件……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………4 所需其他材料…………..……………………………………………………………………………………………………………………………………………………4 存储…………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………………………………………4 靶向特异性引物设计….…………..…………………………………………………………………………………………………………………………………………………4 靶向特异性寡核苷酸设计…….…………..………………………………………………………………………………………………………………………………………………………5 方案 A 部分 – 细胞裂解…….…………..…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6 B 部分 – PCR……….…………..………………………………………………………………………………………………………………………………………………6 C 部分 – sgRNA 合成………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………7 D 部分 – 体外 Cas9 裂解 ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….9 E 部分 – 裂解产物分析………………………………………………………………………………………………………………………………………………..…..………10
图S2:温度对PAB-AGOG活性酶测定的影响在37、47和57°C下进行,并使用57-MER SSGO或DSGO或DSGO:C作为底物进行了分析(图S1)。(a)在单转弯条件下(20 nm底物/200 nm PAB-AGOG),GO-DNA糖基酶/AP裂解酶活性。上图:动力学曲线 - 对于每种测定,最终的DNA裂解产物被绘制为三个独立实验的孵育时间的函数。如材料和方法中所述,拟合了每种动力学的实验点。下图:从上图中提取的单转换速率常数(K obs)作为SSGO和DSGO的温度的函数,如所示。(b)GO-DNA糖基酶和GO-DNA糖基酶/AP裂解酶的比较分析是温度的函数。孵育时间分别为37、47和57°C的SSGO,分别为蓝色,绿色和红色的DSGO分别为2、1和0,5分钟。深色和浅色条分别用于GO-DNA糖基酶和GO-DNA糖基化酶/AP裂解酶活性。每个条对应于三个独立实验获得的平均值±SD。
2型糖尿病倾向于在成人中发生,因为血糖水平不断增加,这是由于由于各种原因而引起的胰岛素分泌不足或难以使用胰岛素。在所有2型糖尿病患者中,有证据表明,女性的死亡率比男性高(1、2)。持续性高血糖会导致大血管,微血管和神经系统的病理变化,并在严重的情况下对心脏和肾脏造成损害(3)。2型糖尿病的病理很复杂,临床症状可能包括多形焦点,多尿液,多次小径和体重减轻(4,5)。在1980年代初期,发现胰高血糖素样肽1(GLP-1)是在肠道L细胞中产生的胰高血糖素蛋白裂解产物(6)。GLP-1作为一种主要在摄入葡萄糖或混合饮食后分泌的肠道肽,可在生理血浆浓度下增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌,满足所有肠蛋白酶激素的标准(7,8)。GLP-1在2型糖尿病患者中的胰岛素促进作用表明,它在该疾病的药物治疗中具有潜在的作用(9,10)。GLP-1最明显的生理效应是其胰岛素促进作用(6)。值得注意的是,GLP-1在高血糖的情况下仅增加胰岛素释放,因此不会导致低血糖。此外,GLP-1抑制胰腺A释放胰高血糖素,该细胞可能通过胰岛d dymatostatin从细胞局部释放,以介导(10,11)的释放。lilalutide是GLP-1受体激动剂。此外,GLP-1还有许多其他功能:中枢神经系统(CNS)诱导饱腹感和饱腹感(12),降低血压(13),并降低了餐后甘油三酸酯和游离脂肪酸浓度。Liraglutide的标准治疗剂量每天为1.2mg。但是,如果患者对药物的血糖反应不足,建议每天滴定为1.8mg。在第三阶段的Liraglutide临床试验中,在2型糖尿病患者中,HBA1C水平降低了1.1 - 1.8%(14,15)。Liraglutide是一种常用的胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂。In vivo , Liraglutide can bind to GLP-1 receptors on pancreatic beta cells and then stimulate the synthesis and secretion of insulin, which can increase insulin sensitivity in peripheral tissues, enhance insulin-mediated glucose utilization, inhibit hepatic glycogen callogenesis, reduce glucose uptake by intestinal cells and decrease hepatic glucose output ( 16 )。liraglutide还通过对中枢神经系统作用(17)并放慢胃排空时间来增加饱腹感,从而减少了总能量摄入量(18,19)。与短作用化合物不同,长期服用长时间的长效GLP-1受体激动剂似乎不会显着影响胃运动。长效GLP-1受体激动剂对胃排空率缺乏影响76。Dulaglutide是与IgG融合的GLP-1肽。与天然GLP-1相比,Dulaglutide由于其延长的半衰期(〜90小时)而显示出延长的生物学活性,该活性支持该药物的每周给药(15)。每周剂量为0.05 - 8.0mg,在5周后,HBA1C水平下降了0.2 - 1.2%。与需要更频繁给药的短期药物相比,每天或每周一次注射长作用化合物的便利性是一个明显的优势。日常活动频繁变化的患者,例如业务