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SAFER-Detection 用于有效检测基因编辑人类细胞中的 DNA 重排
评估人类基因组编辑产品安全性的一个重要标准是验证基因组完整性。这包括对大量插入或缺失、外源 DNA 整合以及致癌性或插入诱变可能性的评估。在本研究中，我们介绍了 SAFER-Detection（高效重排检测的选择性扩增）。SAFER-Detection 是一种基于标记和下一代测序的方法，旨在以单碱基分辨率定量检测染色体重排断点。该方法能够对由可编程核酸酶（如 CRISPR/Cas 和 TALEN）进行的靶向和脱靶编辑导致的重排进行分类。SAFER-Detection 使用 Cas9 和 CCR5 向导 RNA，可轻松识别靶位点 (CCR5) 与附近同源物 (CCR2) 中的脱靶或同源位点之间的染色体内缺失、插入和倒位。CCR5 靶位点与 chr1 和 chr13 上的脱靶位点之间的染色体间易位也被捕获并通过 PCR 进一步验证。SAFER-Detection 在检测由脱靶活动或同源重组介导的染色体内和染色体间重排方面表现出高灵敏度，适用于含有低细胞数的样本。当与灵敏的脱靶提名技术（如 ONE-seq）结合使用时，SAFER 检测提供了一种评估治疗性基因组编辑中染色体重排风险的宝贵方法。
使用tranposon- ...
图2：转座酶介导的剪切机制的示意图。（1）转座酶识别并结合了转座子两侧的TIRS，（2）换位复合物，（3）切除换位复合物，（4）转座复合物识别基因组中的靶位点，（5）转座子插入基因组中。图像改编自Skipper，K.A。等，2013 2。
tgCRISPRi：使用截短的 gRNA 和催化活性 Cas9 进行有效的基因敲除
CRISPR 干扰 (CRISPRi) 是一种在哺乳动物细胞中沉默基因的高效方法，它采用酶失活形式的 Cas9 (dCas9) 与一个或多个与靶基因转录起始位点互补 20 个核苷酸 (nt) 的向导 RNA (gRNA) 复合。此类 gRNA/dCas9 复合物与 DNA 结合，阻碍目标基因座的转录。在这里，我们提出了一种替代的基因抑制策略，即使用活性 Cas9 与截短的 gRNA (tgRNA) 复合。Cas9/tgRNA 复合物与特定靶位点结合而不会触发 DNA 切割。当靶向转录起始位点附近时，这些短的 14-15 nts tgRNA 可有效抑制果蝇体细胞组织中几种靶基因的表达，而不会产生任何可检测到的靶位点突变。 tgRNA 在与 Cas9-VPR 融合蛋白复合时还可以激活靶基因表达或调节增强子活性，并且可以整合到基因驱动中，其中传统 gRNA 维持驱动，而 tgRNA 抑制靶基因表达。
当前的 gRNA 排序预测算法对植物基因组编辑有用吗？
通过传统育种将新特性引入作物通常需要几十年的时间，但最近开发的基因组序列修饰技术有可能加速这一过程。这些新育种技术之一依赖于 RNA 指导的 DNA 核酸酶 (CRISPR/Cas9) 在体内切割基因组 DNA，以促进序列的删除或插入。这种序列特异性靶向由向导 RNA (gRNA) 决定。然而，选择最佳 gRNA 序列有其挑战。几乎所有当前用于植物的 gRNA 设计工具都是基于动物实验数据，尽管许多工具允许使用植物基因组来识别潜在的脱靶位点。在这里，我们检查了八种不同的在线 gRNA 位点工具的预测一致性和性能。不幸的是，不同算法的排名之间几乎没有共识，排名与体内有效性之间也没有统计学上显着的相关性。这表明，影响植物中 gRNA 性能和/或靶位点可及性的重要因素尚未阐明并纳入 gRNA 位点预测工具中。
纳伊姆，法蒂玛
通过传统育种将新特性引入作物通常需要几十年的时间，但最近开发的基因组序列修饰技术有可能加速这一过程。这些新育种技术之一依赖于 RNA 指导的 DNA 核酸酶 (CRISPR/Cas9) 在体内切割基因组 DNA，以促进序列的删除或插入。这种序列特异性靶向由向导 RNA (gRNA) 决定。然而，选择最佳 gRNA 序列有其挑战。几乎所有当前用于植物的 gRNA 设计工具都是基于动物实验数据，尽管许多工具允许使用植物基因组来识别潜在的脱靶位点。在这里，我们检查了八种不同的在线 gRNA 位点工具的预测一致性和性能。不幸的是，不同算法的排名之间几乎没有共识，排名与体内有效性之间也没有统计学上显着的相关性。这表明，影响植物中 gRNA 性能和/或靶位点可及性的重要因素尚未阐明并纳入 gRNA 位点预测工具中。
CRISPR/Cas9 介导的 BnFAD2 和 BnFAE1 基因编辑改变了油菜中的脂肪酸谱
摘要：脂肪酸组成决定了油料作物油脂的品质，是遗传改良的重要目标。FAD2（脂肪酸脱氢酶2）和FAE1（脂肪酸延长酶1）是关键的脂肪酸合成基因，已成为遗传操作改变油料植物脂肪酸组成的重点研究对象。本研究以油菜品种CY2（含油量约50%；其中芥酸含量为40%）为营养品质，利用CRISPR/Cas9介导的BnFAD2和BnFAE1基因基因组编辑技术，获得新型敲除植物。设计两条引导RNA，分别针对一个拷贝的BnFAD2基因和两个拷贝的BnFAE1基因。通过序列分析，鉴定出一些在BnFAD2和BnFAE1基因的3个靶位点发生突变的株系。其中三个品系在 BnFAD2 和 BnFAE1 基因的所有三个靶位点均发生了突变。种子脂肪酸组成分析表明，所有三个位点的突变导致油酸含量（70–80%）与 CY2（20%）相比显著增加，芥酸含量大大降低，多不饱和脂肪酸含量略有下降。我们的结果证实了 CRISPR/Cas9 系统是改良这一重要性状的有效工具。
how- acidic-amino-acid-acid-racidues-facilites-dna-taget-stite-
尽管DNA骨架的负电荷，但酸性残基（ASP/GLU）通常参与基础读数，对胞嘧啶的偏爱很偏爱。实际上，在已解决的DNA/蛋白质结构中，几乎完全通过ASP/GLU通过直接的氢键识别胞嘧啶，而与此同时，腺嘌呤，无论其氨基群如何，都没有显示出ASP/GLU的倾向。在这里，我们分析了ASP/GLU使用所选转录因子的经典和缩写模拟对序列特异性DNA结合的贡献，并发现它受骨链磷酸盐的排斥与有吸引力的相互作用与胞质相互作用之间的细分平衡。特别是，ASP/Glu降低了非循环位点的属性，因此充当了防止脱靶结合的负选择器。在含胞嘧啶的位点，有利的贡献不仅依赖于单个H键的形成，而且通常需要由多个细胞穿刺产生的阳性势能，而靶位点中观察到的过量的胞嘧啶在靶位点中始终如一。最后，我们表明，ASP/GLU对胞嘧啶而不是腺嘌呤的偏好是腺嘌呤咪唑环的排斥以及嘌呤 - 嘌呤二核苷酸采用BII构象的趋势。
Combi‐CRISPR：NHEJ 和 HDR 的结合提供了……
摘要 CRISPR-Cas9 广泛用于小鼠和大鼠的基因靶向。非同源末端连接 (NHEJ) 修复途径在受精卵中占主导地位，可有效诱导插入或缺失 (indel) 突变，从而在靶位点敲除基因，而通过同源定向修复 (HDR) 的基因敲入 (KI) 则难以产生。在本研究中，我们使用双链 DNA (dsDNA) 供体模板与 Cas9 和两个单向导 RNA，一个用于切割目标基因组序列，另一个用于切割 dsDNA 质粒的侧翼基因组区域和一个同源臂，在 G0 幼崽中产生 20-33% 的 KI 效率。 G0 KI 小鼠在一个靶位点携带 NHEJ 依赖的插入/缺失突变，该突变设计在内含子区域，而在另一个外显子位点携带 HDR 依赖的各种供体盒（例如 EGFP 、mCherry 、Cre 和感兴趣的基因）的精确 KI，这些供体盒的长度从 1 到 5 kbp 不等。这些发现表明，这种由 CRISPR-Cas9 系统介导的 NHEJ 和 HDR 组合方法有助于在小鼠和大鼠中高效、精确地 KI 质粒 DNA 盒。
使用 TALE-BE 进行高效的多工具/多重基因工程
TALE 碱基编辑器是最近添加到基因组编辑工具箱中的。这些分子工具是转录激活因子样效应结构域 (TALE)、分裂 DddA 脱氨酶半体和尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合，它们具有直接编辑双链 DNA 的独特能力，将胞嘧啶 (C) 转化为胸腺嘧啶 (T)。为了剖析 TALE-BE 的编辑规则，我们将数十个靶向核基因组位点的 TALE-BE 的筛选与基于将 TALE-BE 靶位点集合精确敲入细胞基因组的中/高通量策略相结合。后一种方法使我们能够深入了解 cellulo 中的编辑规则，同时排除不同基因组位点之间的表观遗传和微环境差异等混杂因素。利用获得的知识，我们设计了靶向 CD52 的 TALE-BE，并实现了非常高的基因敲除频率（高达 80% 的表型 CD52 敲除）。我们进一步证明 TALE-BE 仅产生微不足道的插入/缺失和副产物。最后，我们将两种分子工具（TALE-BE 和 TALEN）结合起来进行多重基因组工程，产生高水平的双基因敲除（~75%），而不会在两个靶位点之间产生易位。