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World File Search System光漂白
一种针对神经元精确基因组编辑的优化CRISPR/CAS9方法
摘要在非分裂细胞（如神经元）中，大型DNA片段对标记内源性蛋白的有效敲入仍然尤其具有挑战性。，我们以T WO（TKIT）指南为基于CRISPR/CAS9的新方法开发了T ARGE，以高效且精确的基因组敲入。通过靶向非编码区域TKIT对indel突变具有抗性。我们证明了具有各种标签的内源性突触蛋白的TKIT标记，在小鼠原发性培养的神经元中的效率高达42％。在小鼠中利用子宫电穿孔或病毒注射，可以将AMPAR亚基标记为超超金霉素，从而可以使用两光子显微镜在体内可视化内源性AMPARS。我们进一步使用TKIT来评估内源性AMPAR的迁移率，并在光漂白后荧光回收率。最后，我们表明TKIT可用于标记大鼠神经元中的AMPAR，在另一种模型生物体中证明了精确的基因组编辑，并突出了TKIT作为可视化内源性蛋白质的方法的广泛潜力。
mCherry 明亮变体的定向进化：......
图片标题 图 S1 C9 和 C12 变体的 EP-PCR 文库。 图 S2 对 mCherry 家族进行诱变努力以实现寿命进化的总结。 图 S3 空间远距离替换对光物理特性的作用。 图 S4 寿命和酵母细胞共同进化轨迹。 图 S5 哺乳动物细胞的细胞亮度。 图 S6 大肠杆菌的光漂白趋势。 图 S7 比较大肠杆菌在激发速率标准化条件下的光稳定性。 图 S8 归一化的吸收和发射光谱。 图 S9 变体的荧光各向异性衰减和旋转时间常数（τ r）。 图 S10 变体的荧光衰减和平均寿命（τ）。 图 S11 变体的荧光量子产率（）。 图 S12 mCherry 变体的辐射速率常数分析。图 S13 总非辐射速率常数与能隙的拟合。图 S14 相关可观测量的示意图。图 S15 波数尺度上的吸光度和荧光光谱。图 S16 方程 S2 中的分子和分母函数。补充数据表列表
开发了FTOB，一种由DNA制成的荧光标签，具有高光稳定性
[概述]生命科学研究和阐明疾病机制需要高的时间分辨率，这允许观察蛋白质和其他物质在毫秒中的精细运动。现有的蛋白质标签具有有限的光稳定性和亮度，使这些观察结果变得困难。 该研究团队由Tohoku大学跨学科科学领域研究所的Niwa Shinsuke领导，Kita Tomoki的一名研究生开发了一个名为“ FTOB（Fluorescent-LabeLed Tiny DNA折纸）的新荧光标签”，使用DNA与DNA进行了DNA，并与Associent in University a Engine atiforing Mie Suie Mie Yuki合作。与常规标签相比，该FTOB不太可能引起光漂白或眨眼，并且通过极高的时间分辨率，可以观察到蛋白质的运动至少几十分钟。此外，FTOB被设计为使用称为“ DNA折纸”的技术自由重组，就像块一样，可以广泛应用于研究生命现象，例如细胞分裂和与各种疾病（例如阿尔茨海默氏病和癌症）相关的蛋白质。 该结果于2025年2月11日在线发表在“学术杂志”细胞报告物理科学报告中。
改变蛋白-DNA相互作用在复制起源许可期间促进ORC结合位点交换
在ORC和BPR之间作为“ ORC-BPR”相互作用（图1a，第一个面板，虚线框）。使用总内反射荧光（TIRF）显微镜，我们监测了溶液与表面束缚的原点DNA中的ORC C的共定位（23）。在每个ORC-DNA共定位事件中，我们测量了有效的ORC C•+51 FRET效率（E FRET）以检查ORC诱导的DNA弯曲。当兽人到达DNA时，我们一直观察到高兽人C•+51 e fret状态，表明兽人与ACS和BPR结合，并且绑定的DNA弯曲（图。1C-D）。大多数ORC C•+51 E FRET值以0.62为中心（图1d）。尽管它们代表兽人共定位时间的0.5％，但我们还观察到了较低的E fret值的短期（<0.28，图。1C-D，SI附录，图 s1b）。 这些低E FRET值不是由光漂白引起的，因为我们在实验后通过受体激发检查了DNA耦合的荧光团，并将分析限制为将荧光保持到实验结束的DNA分子。 此外，对照实验表明，这些低E fret值不是由沿着DNA滑动而引起的，以远离ACS（SI附录，图。 s2）。 我们排除了在DNA共定位期间任何时候都没有显示高E FRET信号的小部分（约2％）的兽人分子，因为这些可能代表了非特异性的ORC结合。 单个高斯模型在低E fret值下的差（图） 1b）。1C-D，SI附录，图s1b）。这些低E FRET值不是由光漂白引起的，因为我们在实验后通过受体激发检查了DNA耦合的荧光团，并将分析限制为将荧光保持到实验结束的DNA分子。此外，对照实验表明，这些低E fret值不是由沿着DNA滑动而引起的，以远离ACS（SI附录，图。s2）。我们排除了在DNA共定位期间任何时候都没有显示高E FRET信号的小部分（约2％）的兽人分子，因为这些可能代表了非特异性的ORC结合。单个高斯模型在低E fret值下的差（图1b）。1d，插图中的红色曲线表明在弯曲或无形构象状态下存在不同的种群。我们得出的结论是，低E fret值反映了一个无分的状态，其中兽人在ACS处保持绑定，但兽人相互作用丢失（图添加Cdc6会提高DNA上的ORC稳定性，从而导致
使用跨颗粒波前显微镜
荧光显微镜是细胞生物学1 - 3中普遍存在的表征技术。活细胞的荧光标记不仅可以专门突出生物分子，细胞器或细胞室，还可以绘制物理化学量，例如离子浓度，动作电位，pH，pH，分子方向等。在过去的二十年中，荧光显微镜经历了深刻的改进，并开发了许多变体，从而在空间分辨率，速度，信号噪声比率，特异性，标记技术和3D成像方面推动了成像的极限。然而，荧光显微镜受到限制。它本质上仍然是侵入性的，因为它需要用分子染料或蛋白质4将样品标记。此外，由于荧光标签的光漂白和光吸毒性，无法任意长时间进行实时观察。最后，荧光分子并不总是忠实地标记它们应该的内容，而伪影有时会发生5。定量相显微镜（QPM）是另一个专门针对细胞生物学领域6、7的成像技术家族。与荧光显微镜不同，QPM技术不含标签且非特异性。它们仅对样品的折射率敏感。他们的主要好处是与明亮的场显微镜相比，提供更好的对比度。由于QPM不含标签，因此它们不会遭受与荧光显微镜相关的上述缺陷。但是，QPM本质上不是特定的。此外，生物学介质的折射率和质量密度之间存在的密切关系为QPM提供了QPM的独特能力，可以测量和映射培养物中细胞的质量，从而实现细胞生长的定量监测，以及在第8-11级的亚细胞级别的质量转运。尤其没有任何分子探针的光漂白，并且如果使用红色或红外照明，可以取消光毒性，以非侵入性的方式使图像获取为任意长时间的习得12。一个人无法选择细胞的功能来突出显示，尽管最近一些涉及机器学习的作品试图提高此限制13，14。荧光显微镜和QPM因此以互补方法的形式出现，并将它们结合起来提供多种好处。OPD图像显示的细节在荧光图像中无法看到，反之亦然。OPD揭示了细胞中的所有内容，尤其是细胞的部分未荧光标记的部分。例如，它可以清楚地突出片状膜，核，囊泡或线粒体。相反，荧光受特异性受益，因为它仅突出显示细胞中标记的物体，尤其是对比度太低的对象，无法在OPD图像上看到。然而，荧光显微镜和QPM很少相关。然而，将荧光显微镜与QPM技术偶联至少具有三个重要应用：（i）它将提供生物分子或细胞器的空间分布（例如微管，肌动蛋白，线粒体等）或物理化学参数与细胞的总体形态相关，并具有出色的对比度，包括细胞的微弱部分，例如层状脂肪膜。我们设想重要的应用，例如在细胞内贩运研究中；
一种一般的自动荧光方法来表征聚合进度
摘要：开发了一种自发荧光技术来表征实时/在线的聚合进展，该技术在单体或聚合物上没有典型的荧光基团的情况下起作用。单体双环戊二烯和聚合物聚环戊二烯是缺乏传统的荧光光谱官能团的碳氢化合物。在这里，利用了芳族催化环的元置聚合（ROMP）在含有该单体和聚合物的配方的自发荧光进行反应监测。光漂白后的荧光恢复（FRAP）和此处开发的荧光寿命恢复（FLRAP）在这些天然系统中的聚合进展（FLRAP）（FLRAP）不需要外源性荧光团。（自动）聚合过程中荧光寿命的恢复变化线性与治疗程度相关，从而提供了与反应进度的定量联系。这些变化的信号还提供了背景聚合的相对速率，从而可以比较10种不同的催化剂 - 抑制剂稳定的配方。多孔分析证明了对热固性制剂的未来高通量评估的适用性。组合自动荧光和FLRAP/FRAP方法的中心概念可能扩展到监测以前由于缺乏明显的荧光手柄而被忽视的其他聚合反应。
微创DNA介导的光稳定化，用于扩展的单分子和超分辨率成像
荧光标签的光漂白在单分子和超分辨率显微镜下构成了主要限制。常规的光稳定方法，例如去除氧气和添加高浓度的光稳定添加剂，通常需要仔细的荧光团选择，并且可能破坏生物学环境。为了解决这些局限性，我们开发了一种模块化和微创光稳定方法，该方法利用了DNA介导的光稳定剂直接传递到成像位点。在较低的激发强度下，DNA介导的策略优于基于溶液的方法，以显着较低的添加剂浓度实现有效的光稳定。然而，在较高的激发强度下，单个光稳定器分子的稳定性成为限制因素。为了克服这一点并减少了DNA-Paint实验中的局部化损失，我们还实施了恢复方案，在成像位点不断补充光稳定剂。我们进一步扩展了细胞成像的方法，证明了3D-DNA涂料测量中的定位率和精度提高了。DNA介导的光稳定化为禁止高添加剂浓度的成像应用提供了有希望的解决方案。其模块化启用适应性
简单的表面处理 - 偶联 -
摘要：将有机半导体聚合物与生物学物质有效接口的物质特性对齐对于它们在生物电子设备中的使用至关重要。合成修饰和高级加工技术通常被用于促进细胞粘附和生长。在这项研究中，我们将UV-ozone（UVO）处理作为修改PDPP3T膜的简单替代方法。暴露于UVO会增加半导体表面的极性，如接触角和XPS分析所证实。在优化时间（t≥30s）下及以上的表面处理导致了施旺细胞的生长增强，其行为与标准组织培养塑料（TCP）相当。同时，长时间的暴露开始引起聚合物的光学特性的重大变化，逐渐闪入光漂白导致半导体行为的降低至30 s以上。使用电阻抗光谱测试了紫外线处理的PDPP3T的最佳生物结合特性，该技术在半导体聚合物对支持细胞生存力和增殖方面的有效性进行了使用。这项工作证明了更容易将共轭聚合物与生物环境整合在一起的潜力，从而扩大了探索在存在生物细胞中离子扩散与半导体电动性之间相互作用的机会。
海报演示摘要
三光子头式显微镜用于记录神经元活性。他们的技术局限性包括成像深度，改变焦平面时对动物行为的干扰以及在点燃环境中无法形象的成像。klioutch-Nikov，Kerr和同事开发了一个头部安装的三光子激发显微镜，可以在点燃环境中自由移动的小鼠中的所有皮层分辨率以单神经元分辨率进行成像。作者设计了一个轻巧的显微镜，具有远程聚焦，扩展的Z范围和高分辨率。设置允许适当的动物活动能力和头部取向。作者对表达钙指标的神经元进行了成像，并以无标签方法对血管结构进行了成像。他们在几天内对4和6进行了神经元活性的重复测量，并以最小的或没有光漂白或光损伤进行了测量。一个两通道检测器系统使作者能够提高收集效率，从而在暗中和点燃的环境中进行成像，而没有明显的信号检测发生变化，并且在两个条件之间的过渡中没有伪像。第4层和第6层神经元在光线和黑暗环境中具有活性，当光条件切换时，神经元活性稀疏。开发的成像设置可以在自然条件下记录。Elisa Floriddia自然神经科学
逃脱聚合物纳米颗粒-RSC Publishing
SMLM可以进一步分为三个主要家族，具体取决于单个荧光分子分离的机制：（i）基于光激活/开关显微镜，包括光激活的定位显微镜（PALM），Sto-Chastic光学光学重建显微镜（Storm），Direct Storm（Distorm）； （ii）动态标记显微镜，包括基于可逆结合的纳米级地形（油漆）成像的点积累，以及（iii）荧光终身分离显微镜。所有这些方法，基于不同的分离方法，都具有自己的优势，并且在生物学和材料科学方面都有用，如其他地方彻底综述。5–11中，由于各种样品中动态标记的实用性，油漆正在增长。从这个角度来看，我们旨在在油漆显微镜下对探针设计中的最新状态提供见解，并将工具箱扩展到DNA之外，以探针为探针。油漆的概念是基于以下前提：荧光探针旨在使用溶液自由地差异分子（图1，中间面板）。与目标结合后，它们被固定，并且单分子的荧光信号出现在摄像机上，可以通过拟合程序定位。作为探针的动力学确保解开，荧光信号再次旋转，直到新分子结合。随着探针的连续补充，它对光漂白不敏感，这是该方法的主要优势，而不是其他SMLM技术。这允许长时间的成像时间，从而具有更高的精度。此外，通过将多个探针与不同的染料相结合，