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piggyPrime：人类细胞中的高效 Prime 编辑......
基于 CRISPR-Cas9 系统的 Prime Editing（Jinek 等人，2012 年；Jinek 等人，2013 年；Ran 等人，2013 年）通过支持有针对性的插入、删除或 12 种可能的单碱基替换中的任何一种，实现基因组的精确编辑。通过 Prime Editing 进行的基因编辑既不涉及供体模板，也不涉及双链断裂（Anzalone 等人，2019 年）。Prime Editing 的这些独特属性基于 Prime Editor (PE) 的传递，该 Prime Editor 由 Cas9-逆转录酶融合蛋白（以下称为 PE2）以及 Prime Editing 向导 RNA（pegRNA）组成，后者指定基因组靶标以及要直接写入基因组的所需编辑。 Prime 编辑在治疗致病突变以及生成疾病模型（体外和体内）方面具有巨大潜力（Schene 等人，2020 年；Jang 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Liu 等人，2021 年；Park 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年；Qian 等人，2021 年）。然而，目前 Prime 编辑的使用受到低效率的挑战，导致需要耗费大量的优化和/或筛选方法才能实现令人满意的编辑效果（Liu 等人，2020 年；Schene 等人，2020 年；Chemello 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年）。将编码传统 CRISPR 效应物（如 Cas9 和单向导 RNA）的基因盒稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，已广泛应用于生命科学研究，包括用于生成模型细胞系和 CRISPR 筛选（Shalem 等人，2014 年；Holmgaard 等人，2017 年；Thomsen 等人，2020 年）。对于主要编辑，由于 PE2 编码序列较大（6351 bp），因此难以将 PE2 表达盒有效整合到哺乳动物细胞基因组中。由于包装能力有限，这使病毒载体的使用变得困难（Kumar 等人，2001 年），到目前为止，PE2 系统仅通过使用两个独立的慢病毒载体递送内含肽分裂 PE2 盒而整合到哺乳动物细胞基因组中（Anzalone 等人，2019 年）。这里我们介绍了 piggyPrime，这是一种非病毒单载体系统，可利用 piggyBac 转座子系统的强大整合能力，轻松高效地将所有主要编辑组件整合到人类细胞中。重要的是，DNA 转座促进的 PE2 和 pegRNA 的长期表达支持提高主要编辑水平，从而为有效转基因提供了一种新方法。
共价连接的腺病毒-AAV 复合物作为基因治疗的新型平台技术
Logan Thrasher Collins，1,2 Wandy Beatty，3 Buhle Moyo，4 Michele Alves-Bezerra，5 Ayrea Hurley，5 William Lagor，6 Gang Bao，4 Zhi Hong Lu，2 David T. Curiel 2，* 1 圣路易斯华盛顿大学生物医学工程系；2 圣路易斯华盛顿大学放射肿瘤学系；3 圣路易斯华盛顿大学分子微生物学系；4 莱斯大学生物工程系；5 贝勒医学院分子生理学和生物物理学系；6 贝勒医学院综合生理学系，* 通讯作者。摘要：腺相关病毒 (AAV) 作为基因治疗的递送系统取得了巨大成功，但 AAV 仅有 4.7 kb 的包装容量严重限制了其应用范围。此外，通常需要高剂量的 AAV 来促进治疗效果，从而导致急性毒性问题。虽然已经开发了双重和三重 AAV 方法来缓解包装容量问题，但这些方法需要更高的剂量才能确保以足够的频率发生共感染。为了应对这些挑战，我们在此描述了一种由共价连接到多个腺相关病毒 (AAV) 衣壳的腺病毒 (Ad) 组成的新型递送系统，这是一种以较少的 AAV 总量更有效地共感染细胞的新方法。我们利用 DogTag-DogCatcher (DgT-DgC) 分子胶系统构建我们的 AdAAV，并证明这些混合病毒复合物可实现培养细胞的增强共转导。该技术最终可能会通过提供双重或三重 AAV 的替代方案来扩大 AAV 基因递送的实用性，该替代方案可以在较低剂量下使用，同时达到更高的共转导效率。简介尽管腺相关病毒 (AAV) 基因治疗已显示出巨大的前景并已导致 5 种治疗方法获得临床批准，1–3 但该载体的 DNA 包装能力较低（4.7 kb），一直阻碍着它的应用。人们付出了巨大的努力来开发双重 AAV 系统，该系统将治疗基因的两部分放在不同的衣壳中，旨在共同感染相同的细胞。4–7 类似的三重 AAV 系统也已被探索。8,9 双重和三重 AAV 系统可以通过 DNA 反式剪接、RNA 反式剪接或通过分裂内含肽的蛋白质剪接机制将其分裂的基因重新组合成完整形式。5,7 然而，双重和三重 AAV 通常需要更高的剂量才能实现有效的细胞共转导，尤其是在需要全身给药时。10 这是有道理的，因为两三个货物到达同一个细胞的可能性应该大致分别对应于单个货物到达细胞的比例的平方或立方。因此，大多数双重或三重 AAV 策略都集中于可以局部给药到目标组织的应用，例如视网膜基因治疗。5，7–9 双重和三重 AAV 的另一个缺点是，它们可能导致未接收所有货物的细胞产生部分蛋白质产物。5 由于这些部分蛋白质的翻译量通常比所需的治疗性蛋白质还要大，因此它们可能导致严重的毒性。缓解双重和三重 AAV 基因治疗相关问题的新方法将大大提高 AAV 在治疗需要递送大量转基因序列的疾病方面的适用性。为了应对这些挑战，我们在此构建了一种全新的基因递送系统“AdAAV”，它由更大的（直径约 100 纳米）Ad 衣壳组成，衣壳上装饰有