摘要 通过将催化失活的 Cas9 (dCas9) 与组蛋白脱乙酰酶 (Sir2a) 或乙酰转移酶 (GCN5) 的活性域融合,该 CRISPR 干扰/激活 (CRISPRi/a) 系统允许在转录水平上进行基因调控,而不会导致寄生虫基因组发生永久性变化。然而,dCas9 的组成性表达对研究必需基因构成了挑战,这可能会导致寄生虫的适应性变化,掩盖真正的表型。在这里,我们开发了一种无泄漏诱导型 CRISPRi/a 系统,通过整合 DiCre/loxP 调节子,允许在雷帕霉素瞬时诱导下表达 dCas9-GCN5/-Sir2a,这允许通过引入针对其转录起始区的向导 RNA 来方便地转录调控感兴趣的基因。利用在无性红细胞发育过程中处于沉默状态或从低水平到高水平表达的八种基因,我们评估了该系统在无性寄生虫中的稳健性和多功能性。对于大多数分析的基因,这种可诱导的 CRISPRi/a 系统导致目标基因在 mRNA 水平上上调或下调 1.5 到 3 倍。PfK13 和 PfMYST 表达的改变导致对青蒿素的敏感性改变。对于自噬相关蛋白 18(与青蒿素抗性相关的必需基因),通过可诱导的 CRISPRi/a 获得了 0.2 倍的上调或下调,导致生长迟缓。对于配子发生的主要调节器 PfAP2-G,通过 CRISPRa 获得了 0.10 倍的 PfAP2-G 转录本增加,导致。诱导寄生虫的配子体血症高出 4 倍。此外,可诱导的 CRISPRi/a 还可以调节配子体中的基因表达。这种可诱导的表观遗传调控系统为研究恶性疟原虫的基因功能提供了一种快速方法。
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