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World File Search System晚疫病
通过改造 EpiC2B 增强晚疫病抗性
木瓜蛋白酶样免疫蛋白酶 (PLCP) 是作物保护的有希望的工程目标，因为它们在番茄、玉米和柑橘等主要作物的植物免疫中发挥着重要作用 (Misas-Villamil 等人，2016 年)。病原体分泌的 PLCP 抑制剂种类繁多，凸显了这些蛋白酶在防御各种病原体方面的重要性。例如，番茄中质外体免疫 PLCP 疫霉菌抑制蛋白酶 1 (Pip1) 的消耗会导致对细菌、真菌和卵菌番茄病原体的超敏性 (Ilyas 等人，2015 年)。然而，Pip1 在野生型番茄中的免疫力并不理想，因为 Pip1 在感染过程中受到多种病原体分泌的抑制剂的抑制，例如来自卵菌晚疫病原体 Phytophthora infestans 的胱抑素样 EpiC2B (Tian 等人，2007)。在这里，我们测试了是否可以通过将 Pip1 改造成 EpiC2B 不敏感的蛋白酶来增加基于 Pip1 的对晚疫病的免疫力。为了指导 Pip1 诱变，我们使用 AlphaFold-Multimer 生成了 EpiC2B-Pip1 复合物的结构模型 (Evans 等人，2022)。该结构模型代表了胱抑素 (EpiC2B) 的三部分楔与木瓜蛋白酶 (Pip1) 的底物结合槽之间的经典相互作用。该模型表明，由于 Pip1 与 EpiC2B 的相互作用表面大于底物结合槽，因此可以对 Pip1 进行工程改造以防止抑制，而不会影响 Pip1 底物特异性（图 1a）。我们选择了九个残基对 Pip1 进行定向诱变，这些残基预计会直接与 EpiC2B 相互作用，但不在底物结合槽中（图 1a）。为了最大程度地破坏蛋白酶-抑制剂相互作用，我们将这些残基替换为带相反电荷的大氨基酸。随后
基于 CRISPR/Cas9 的 PMR4 基因敲除降低了两种番茄品种对晚疫病的易感性
摘要：番茄晚疫病（LB）的病原菌是致病疫霉菌，是一种毁灭性的疾病，严重影响植物的生产力。植物中易感基因（S）的存在促进了病原菌的增殖；因此，抑制这些基因可能有助于提供广谱和持久的耐受性/抗性。先前对拟南芥和番茄的研究表明，PMR4 易感基因的敲除突变体对白粉病具有耐受性。此外，马铃薯中 PMR4 的敲低已被证明可以赋予对 LB 的耐受性。为了在本研究中验证番茄中的相同效果，将含有四个单向导 RNA（sgRNA：sgRNA1、sgRNA6、sgRNA7 和 sgRNA8）的 CRISPR-Cas9 载体（靶向尽可能多的 SlPMR4 区域）通过农杆菌介导的转化引入两种广泛种植的意大利番茄品种：“San Marzano”（SM）和“Oxheart”（OX）。选择了 35 株植物（26 株 SM 和 9 株 OX）并进行筛选，以确定 CRISPR/Cas9 诱导的突变。不同的 sgRNA 导致的突变频率范围从 22.1% 到 100%，或者精确插入（sgRNA6）或缺失（sgRNA7、sgRNA1 和 sgRNA8）。值得注意的是，sgRNA7 在七种 SM 基因型中诱导了纯合状态下的 − 7 bp 缺失，而 sgRNA8 导致产生十五种具有双等位基因突变（ − 7 bp 和 − 2 bp）的 SM 基因型。选定的编辑品系接种了 P. infestans，其中四种在 PMR4 基因座完全敲除的品系与对照植物相比表现出减轻的病害症状（易感性从 55% 降低到 80%）。使用 Illumina 全基因组测序对四种 SM 品系进行测序以进行更深入的表征，而未显示出候选脱靶区域发生任何突变的证据。我们的结果首次表明，pmr4 番茄突变体对致病疫霉菌的易感性降低，证实了 KO PMR4 在提供针对病原体的广谱保护中的作用。
马铃薯人工智能模型能够检测马铃薯晚疫病和早疫病
创新描述：用于检测早疫病和晚疫病的马铃薯 AI 模型已添加到 PlantVillage Nuru 应用程序中，现在可用于 Android 和 iOS 操作系统。这项创新旨在帮助农民在田间诊断作物病害，无需互联网连接。
通过 CRISPR/Cas9 双重靶向对 StERF3 基因进行功能性抑制可增强 Solanum Tuberosum L. 对晚疫病的抵抗力。
分别使用嵌合引物UF/UT (-)和gRT (+)/gR-R进行扩增，其中靶序列被设计在gRT (+)和UT (-)引物中。在嵌套PCR位点特异性引物对的第二个PCR反应中，使用含有BsaI切割位点的Pps/Pgs来扩增带有靶序列的sgRNA表达盒。BsaI位点被设计在用于Golden Gate连接的位点特异性引物中。BsaI属于IIs型限制性内切酶，具有一种新的切割特性，可以产生非回文的独特粘性末端，从而避免自连接和连接不相容末端[39]。我们使用Golden Gate克隆策略制备了pYLCRISPR/Cas9Pubi-BstERF3构建体，该构建体携带两个由OsU6a启动子驱动的sgRNA表达盒，用于马铃薯的基因靶向。