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使用 CRISPR/Cas9 对无融合生殖四倍体草皮和牧草（Paspalum notatum Flügge ́）进行多等位基因编辑
多倍体在禾本科植物中很常见，对传统育种提出了挑战。基因组编辑技术绕过了杂交和自交，能够在一代中对多个基因拷贝进行有针对性的修改，同时保持许多多倍体基因组的杂合背景。巴哈草（Paspalum notatum Flügge ́；2 n =4 x =40）是一种无融合生殖的四倍体 C4 物种，在美国东南部广泛种植，作为肉牛生产和公用事业草坪的饲料。叶绿素生物合成基因镁螯合酶（MgCh）被选为在四倍体巴哈草中建立基因组编辑的快速读出目标。含有 sgRNA、Cas9 和 npt II 的载体通过基因枪法递送到愈伤组织培养物中。通过基于 PCR 的检测和 DNA 测序对编辑植物进行了表征，并观察到高达 99% 的 Illumina 读数的诱变频率。野生型 (WT) 巴哈草的测序显示，MgCh 的序列变异水平很高，这可能是因为存在至少两个拷贝，可能包含八种不同的等位基因，包括假基因。MgCh 突变体表现出明显的叶绿素消耗，叶片绿度降低了 82%。两种品系显示出随时间推移的编辑进展，这与体细胞编辑有关。获得了嵌合 MgCh 编辑事件的无融合生殖后代，并允许在一系列叶绿素消耗表型中识别出统一编辑的后代植物。高度编辑的突变体的 Sanger 测序显示 WT 等位基因的频率升高，可能是由于频繁的同源定向修复 (HDR)。据我们所知，这些实验是首次报道将基因组编辑应用于多年生暖季草皮或牧草。该技术将加速巴哈草品种的开发。
优化 GBS 方案以实现牧草物种的有效基因分型
GBS（测序基因分型）以前被证明是一种经济高效且可靠的方法，可用于对几种牧草进行基因分型 [1; 2]。GBS 通过使用限制性酶来限制要扩增和测序的基因组部分（基因座）来降低基因组的复杂性 [3]。在某些情况下，当基因座数量相对于测序工作量而言很高时，就会生成许多基因座缺失数据的基因分型矩阵。因此，需要优化 GBS 协议以获得最多的基因座数量和最少的缺失数据比例。我们测试了几种限制性酶，并评估了在紫苜蓿（Medicago sativa）和鸭茅（Dactylis glomerata）两个物种中获得的基因座数量。对于紫苜蓿，我们还确定了在 1 066 个种质中获得的 SNP 和缺失数据的数量。