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World File Search System聚合酶链式反应
使用基于过滤器的试剂盒和冷却方法对黑曲霉 DNA 进行质量和数量分离 Renatasya Silviana Herningtyas、Muhammad Taufiq Qur
提交日期：2023 年 11 月 13 日 修订日期：2024 年 4 月 6 日 接受日期：2024 年 6 月 22 日 摘要 聚合酶链式反应 (PCR) 是提高检测真菌感染（例如由黑曲霉引起的感染）灵敏度的重要技术。纯 DNA 和 DNA 分离技术的可用性是实施 PCR 的重要因素。本研究旨在比较使用基于过滤器的试剂盒方法和冷却分离黑曲霉 DNA 的质量和数量。实验研究设计使用琼脂糖凝胶电泳 (1.5%) 对 DNA 分离物进行定性测试，使用紫外可见分光光度计 (波长为 260 nm 和 280 nm) 进行定量 DNA 测试。数据分析比较了两种方法分离的 DNA 的定性和定量结果。结果表明，两种分离方法中都存在 DNA 带，基于过滤器的试剂盒方法中的带较粗使用基于过滤器的试剂盒分离后的 DNA 平均浓度 (6,478 ng/μl) 高于冷却方法 (5,994 ng/μl)。基于过滤器的试剂盒中的 DNA 纯度 (1.7) 也高于冷却方法 (1.1)。基于过滤器的试剂盒方法含有支持成功分离 DNA 的化学成分。可以得出结论，基于过滤器的试剂盒方法比冷却方法产生的黑曲霉 DNA 分离物质量更好、数量更多。这些发现意味着基于过滤器的试剂盒可能是实验室应用中分离黑曲霉 DNA 的更好选择。关键词：黑曲霉；冷却方法；基于过滤器的试剂盒 1. 简介
隆多诺波利斯联邦大学
前列腺癌 (PCa) 是男性中第二常见的癌症类型。已知 BRCA1 和 BRCA2 基因突变与乳腺癌和卵巢癌的进展有关，并且已分析表明其会增加罹患 PCa 的风险。生成有关 BRCA1 和 BRCA 基因表达特征的信息并将其与前列腺癌严重程度标准相关联，对于早期发现这种肿瘤的更具侵袭性的形式非常重要。从 89 名个体中收集了经直肠前列腺活检组织碎片样本。 84 名患者的样本被送去进行分子技术分析，通过聚合酶链式反应 (PCR) 获取 BRCA1 和 BRCA2 转录本表达的相对量。 26 名（30.90%）患者检测出 PCa 呈阳性，且 PSA 水平 > 10 ng/ml（p=0.019）。在 PCa 阳性患者中，BRCA1 和 BRCA2 基因在阴性片段中的中位表达较高，分别为 p=0.002 和 p=0.038。根据 Gleason 分类和 PSA 值，BRCA1 和 BRCA2 基因的表达没有统计学差异。与未患前列腺肿瘤的个体的片段相比，前列腺癌患者的阴性片段中 BRCA1 和 BRCA2 基因的中位表达更高。了解 BRCA1 和 BRCA2 基因的表达、突变与 PCa 发展之间的关系仍然是一项重大挑战。然而，这些基因在癌症患者的阴性片段中表达较多可能推断出它们与恶性表型的发展之间的关系，这可以通过分析大量样本并因此将其与这种疾病的进程联系起来得到证实。
PDF 530.32 K - 微生物与传染病
背景：粪肠球菌 (E. faecalis) 是伊拉克和全世界泌尿道感染 (UTI) 的病原体，尽管它是人类和动物肠道中的共生菌。由于它能够产生各种致病因子，因此可导致不同的疾病。成孔毒素 (溶细胞素) 是这种细菌中毒性最强的因子。目的：本研究旨在从分子水平上研究从 UTI 中分离出的粪肠球菌中溶细胞素毒素的频率。方法：从被诊断患有 UTI 的女性身上采集了 180 份尿液样本。使用传统的实验室和分子方法进行细菌鉴定，并使用改进的 DNA 提取方法进行毒素检测。结果：利用聚合酶链式反应（PCR）技术针对管家基因（ddI）进行特异性引物分析，结果显示27.7%（50\180）的UTI病原体为粪肠球菌。大多数分离株含有溶细胞毒素基因（cylL L ），频率为92%（46\50）。结论：UTI中溶细胞毒素阳性分离株的患病率很高，令人担忧，这表明UTI中毒性菌株的广泛传播。改进的基因检测DNA提取方法成功扩增了管家基因（ddI）和毒力基因（cylL L ），可用于溶细胞毒素检测，该方法可用于医疗和研究目的的快速细菌鉴定和基因检测，样本量大，时间短，成本低。
简短交流 同行评审 猪圆环病毒 2 型皮内和肌肉注射疫苗接种方法对劳动力、生产率的影响比较
猪群特征所有动物均在兽医的监督和照料之下，饲料、水和环境均符合丹麦环境与食品部的要求。饲养员每天监测猪及其环境。所有饲料配给的量均达到或超过猪的正常营养建议。遗传系为长白-约克夏-杜洛克，所有猪均来自同一群母猪。该研究于 2015 年 12 月至 2016 年 4 月在 PCV2 阳性的丹麦育肥猪群中进行，该猪群每年出栏 20,000 头猪。在研究之前，丹麦技术大学哥本哈根国家兽医研究所通过定量聚合酶链式反应 7 分析，通过中等水平的病毒血症 (4 至 6 log 10 PCV2 拷贝/毫升) 确认了活动性 PCV2 感染。该农场共有 8 个房间，每个房间有 16 个双栏，每个栏养 36 到 38 头猪。采用液体饲料系统，两个相邻的单栏共用一个饲料槽（双栏）。饲料转化率 (FCR) 是一个结果参数，因此双栏是研究的统计单位。为简单起见，双栏统计单位在下文中称为栏。在研究期间，标准的农场程序包括房间的全进全出管理、猪抵达时根据体重和性别进行分类，以及在抵达后 5 天开始使用泰乐星（Aivlosin；Salfarm Danmark A/S）进行为期 3 天的治疗，以对抗胞内劳森菌
CIS 展示，一种基于 DNA 的治疗性肽体外筛选技术
CIS 展示是一种基于重组 DNA 的技术，无需克隆即可将表达的肽或蛋白质库与其自身的 DNA 序列连接起来。细菌复制起始蛋白 RepA 的活性是该技术的核心。该蛋白质是一种大肠杆菌质粒复制起始蛋白，具有独特的特性，即专门与其来源的相同 DNA 模板结合——“顺式活性”。CIS 展示提炼了这种天然系统的基本成分，因此 RepA 及其遗传控制元件被携带在短线性 DNA 序列上，该序列可以通过聚合酶链式反应 (PCR) 轻松生成。这些控制元件是 CIS 元件和 ori 区域，它们终止转录复合物，因此可以将新生表达的 RepA 蛋白加载到其自身模板的 ori 区域上。通过编码与 RepA 融合的肽或蛋白质库，表达的库肽附着在其编码 DNA 上（图 1）。随后可以对 DNA 代码进行测序以显示肽序列 (1)。 CIS 展示是一种重组程序，需要细菌转录和翻译机制的组件才能运行；然而，该过程可以在细胞外进行，而噬菌体展示等其他技术则需要在细菌内部复制（1-2）。因此，CIS 展示可以以纯无细胞的方式使用细菌细胞裂解物，从而克服了其他技术需要将 DNA 转移到细胞中的局限性，而转移是一种低效的过程，并且限制了文库的大小。实际上，这意味着 CIS 展示操作简单，可以快速生成和筛选更大的文库，从而缩短从文库设计到命中识别的时间。几天内就可以生成超过 10 13 个与其自身代码相关的不同肽的文库，并在几周内进行筛选。与 RepA 融合的肽专门且有效地与其自身的 DNA 连接：在使用肽标签的测试中，超过 40%
通过农杆菌介导的基因转移获得的编辑植物的分子表征综合方法
摘要 农杆菌介导的基因转移——实际上是基因改造植物最常用的方法——可能导致植物基因组中整合多个 T-DNA 拷贝，以及形成由改造细胞和野生型细胞组成的嵌合组织。因此，对转化株系进行分子表征是一种很好的做法，可以选出最好的株系进行进一步研究。如今，有几种定量和半定量技术可用于估计转基因植物中 T-DNA 的拷贝数 (CN)。在本研究中，我们比较了基于 (1) 实时聚合酶链式反应 (qPCR)、(2) 液滴数字 PCR (ddPCR) 和 (3) 下一代测序 (NGS) 的三种方法，对葡萄编辑株系进行分子表征。这些株系含有通过 CRISPR/Cas9 技术获得的敲除突变，该突变与植物对两种重要的葡萄霉菌病的易感性有关。根据我们的结果，qPCR 和 ddPCR 的输出在准确性方面基本一致，尤其是对于低 CN 值，而 ddPCR 的结果比 qPCR 更精确。关于 NGS 分析，用这种方法检测到的 CN 通常与 qPCR 和 ddPCR 计算的 CN 不一致，并且 NGS 无法区分十个品系中的三个的整合点。尽管如此，NGS 方法可以肯定地识别 T-DNA 截断或串联/倒置重复的存在，从而提供有关转基因整合资产的独特和相关信息。此外，Cas9 和单向导 RNA (sgRNA) 的表达分析以及靶位点的测序增加了与 CN 数据相关的新信息。这项工作通过报告葡萄编辑品系的实际案例研究，探讨了最先进的诊断技术在早期选择合适的转基因材料方面的优缺点。结果可能对开发新转基因品系的科学家和负责转基因控制的实验室都感兴趣。
锌指蛋白靶向霍乱毒素A（ctxA）基因...
摘要 背景与目的：本研究利用锌指核酸酶（ZFN）技术破坏霍乱毒素基因（ctxA），抑制霍乱弧菌（V. cholera）产生CT毒素。实验方法：设计一个工程化的ZFN，靶向ctxA基因的催化位点，将ZFN编码序列克隆到pKD46、pTZ57R T/A载体和E2-crimson质粒中，转化大肠杆菌（E. coli）Top10和霍乱弧菌，通过菌落计数法评估ZFN的转化效果。结果：转化后的大肠杆菌经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹实验未见表达，ctxA基因测序未见突变，pKD46-ZFN质粒聚合酶链式反应结果为阴性。用含有完整 ZFN 序列的 T/A 载体转化大肠杆菌 Top10 产生 7 个菌落，所有菌落均含有具有自连接载体的细菌。用左阵列 ZFN 转化产生 24 个菌落，其中 6 个含有具有自连接载体的细菌，18 个含有具有载体/左阵列的细菌。用含有完整 ZFN 的 E2-深红色载体转化霍乱弧菌未产生任何菌落。用左阵列载体转化产生 17 个含有具有载体/左阵列的细菌的菌落。使用蛋白质印迹分析捕获左阵列蛋白带。结论和意义：由于缺乏非同源末端连接 (NHEJ) 机制，ZFN 可能脱靶细菌基因组，从而导致致命的双链 DNA 断裂。建议开发针对细菌基因的 ZFN，具有 NHEJ 修复系统的工程包装宿主是必不可少的。关键词：ctxA 基因；基因编辑工具；霍乱弧菌；锌指核酸酶。
培养的野猪细胞 科学备忘录
• 用于建立细胞系的细胞最初是从家养约克夏猪的皮下腹部脂肪组织活检中分离出来的。分离的细胞使用已验证其预期用途的标准方法（包括显微镜检查）进行表型鉴定。• 细胞系是通过选择性培养贴壁细胞，使其从含血清培养基生长到无血清培养基，经过几代（传代）培养而建立的。使用猪特异性聚合酶链式反应 (PCR) 检测来验证物种身份，并通过核型分析（正常染色体扩散）来评估遗传稳定性。• 细胞的培养方式如下：首先在贴壁培养增殖期增加细胞总数，然后进入细胞育肥期，在此阶段，细胞在特定培养基因子的诱导下形成细胞内脂滴。• 通过添加收获液分离细胞、离心、清洗，并在温控环境下储存在无菌容器中。 • 清洗后收获的材料被描述为培养的猪肉（Sus scrofa domesticus）脂肪细胞，其脂肪酸含量与传统猪肉脂肪产品相似。并提供了微生物、毒性重金属和微量金属的规格。• 我们评估了有关细胞系、生产工艺（包括建立细胞库）、生产过程中使用的物质以及收获的细胞材料特性的信息，包括可披露的安全叙述中提供的信息以及补充保密材料中支持性佐证信息。• 根据 CCC 000008 中提供的数据和信息，我们目前对 Mission Barns 的结论没有任何疑问，该结论认为，由 CCC 000008 中定义的生产工艺产生的培养猪肉脂肪细胞材料构成或含有该材料的食品与通过其他方法生产的同类食品 1 一样安全。此外，我们尚未发现任何信息表明所述生产工艺
原创研究8-氧鸟嘌呤-DNA-糖基化酶基因多态性及交变磁场对外周血流敏感性的影响
背景：动物和细胞中活性氧 (ROS) 的产生通常是由于暴露于低强度因素（包括磁场）所致。关于氧化应激的引发以及 ROS 和自由基在磁场影响中的作用的讨论大多集中在自由基诱导的 DNA 损伤上。方法：用分光光度法测定最终溶液中的 DNA 浓度。通过聚合酶链式反应对 8-氧鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 (hOGG1) 基因的多态性变体 rs1052133 进行分型。采用酶联免疫吸附测定法测定 DNA 中的 8-氧鸟嘌呤水平。为了处理暴露于交变磁场的样品，作者开发了一种在交变磁场中自动研究生物流体的装置。用分光光度法测定 DNA 水溶液中过氧化氢的含量。结果：实验确定，在低频磁场作用下，水介质中过氧化氢的浓度增加3至5倍，会降低基因组材料对氧化修饰的抵抗力以及DNA中8-氧鸟嘌呤的积累。提出了低频磁场对核酸和蛋白质水溶液作用机理的模型，该模型满足水介质中活性氧物质转化的化学振荡器模型。该模型说明了DNA水溶液中发生的过程的振荡性质，并可以预测生物聚合物水溶液中过氧化氢浓度的变化，这取决于作用的低强度磁场的频率。结论：低强度磁场对生物系统影响的机制中关键因素是化学振荡器水环境中ROS的生成，其中物理和化学过程（电子转移，自由基的衰变和加成反应，自旋磁诱导的转化，最长寿命形式过氧化氢的合成和衰变）的竞争受磁场控制。
DNMT3a 促进 LUAD 细胞增殖和转移...
背景：DNA甲基化模式的变化与肿瘤的发生发展密切相关，其中DNA甲基转移酶3α（DNMT3a）起着重要作用。但DNMT3a在肺腺癌（LUAD）中的作用和机制尚不清楚。本研究旨在探讨DNMT3a对LUAD细胞增殖和转移的潜在影响并探索其潜在的分子机制。方法：采用免疫组化和Kaplan-Meier生存分析方法探讨DNMT3a和组蛋白去乙酰化酶7（HDAC7）的表达与患者生存、预后及临床病理特征的关系。在体内和体外研究DNMT3a对LUAD细胞增殖和转移的影响。本研究采用重组慢病毒介导的体外基因过表达或敲减、蛋白质印迹法、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）等方法，阐明DNMT3a促进LUAD细胞增殖和转移的潜在分子机制。结果：DNMT3a或HDAC7高表达与LUAD患者预后不良、AJCC第8版分期高、肿瘤分化差呈正相关，DNMT3a/HDAC7共同低表达的LUAD患者预后最差。DNMT3a上调可以通过上调HDAC7，进一步激活下游介质ZEB1和c-Myc的表达，促进LUAD细胞增殖和转移。相反，HDAC7 的过表达逆转了由 DNMT3a 下调介导的肿瘤生长和转移的减弱以及 c-Myc 和 ZEB1 表达的抑制，进一步表明 LUAD 中 DNMT3a 和 HDAC7 之间存在正反馈调节。结论：我们的研究结果首次证实，DNMT3a 通过上调 HDAC7 并进一步诱导 ZEB1 和 c-Myc 上调，充当诱导 LUAD 恶性进展的肿瘤启动子。靶向 DNMT3a 和 HDAC7 可能是 LUAD 的一种有前途的治疗策略。