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World File Search System脱氨酶
DNA 胞嘧啶脱氨酶 APOBEC3B 的 R 环编辑决定了雌激素受体增强剂的活性
1. 英国伦敦癌症研究所癌症药物研发中心 7 2. 上海生物制品研究所，上海，中国 8 3. 广东工业大学生物医学与制药科学研究所，广州，中国 9 4. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所，深圳，中国 10 5. 广州医科大学 GMU-GIBH 联合生命科学学院，广州，中国 11
用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
加州大学圣地亚哥分校
摘要 作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 (ADAR) 可以重新用于实现可编程的 RNA 编辑，然而它们的外源递送会导致转录组范围的脱靶，此外，对某些 RNA 基序（尤其是那些由 5' 鸟苷侧翼的 RNA 基序）的酶活性非常低，因此限制了它们作为转录组工程工具集的效用。为了解决这些问题，我们首先对 ADAR2 脱氨酶结构域进行了新的深度突变扫描，直接测量了 261 个残基上每个氨基酸替换对 RNA 编辑的影响。这使我们能够创建一个域范围的诱变图，同时还揭示了一种新的高活性变体，其在 5'-GAN-3' 基序处具有改进的酶活性。由于 ADAR 酶（尤其是高活性变体）的过度表达会导致转录组范围内的显著脱靶，我们接下来设计了一种分裂的 ADAR2 脱氨酶，与全长脱氨酶过度表达相比，其 RNA 编辑特异性提高了 100 倍以上。总之，我们预计 ADAR2 脱氨酶结构域的这种系统工程将使 ADAR 工具集在 RNA 生物技术应用中具有更广泛的用途。
编辑的作用是什么？了解腺苷脱氨酶作用于 RNA 的 A-to-I RNA 编辑的生理功能
腺苷到肌苷 (A-to-I) 编辑是一种 RNA 转录后修饰，可改变其序列、编码潜力和二级结构。在作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 (ADAR) 蛋白 ADAR1 和 ADAR2 的催化下，A-to-I 编辑发生在小鼠的约 50 000 – 150 000 个位点上，而人类的位点则达到数百万个。绝大多数 A-to-I 编辑发生在重复元素中，这解释了物种间位点总数的差异。ADAR1 在哺乳动物中编辑的主要物种保守作用是抑制未编辑的细胞来源的内源性 RNA 引起的先天免疫激活。在没有编辑的情况下，反向配对序列（例如 Alu 元素）被认为会形成稳定的双链 RNA (dsRNA) 结构，从而触发 dsRNA 传感器（例如 MDA5）的激活。一小部分编辑位点位于编码序列内，并且在后生动物中进化保守。已证明 ADAR2 编辑对于大脑神经递质受体的重新编码具有生理重要性。此外，RNA 编辑的变化与各种病理状态有关，从严重的自身免疫性疾病 Aicardi-Goutières 综合征到各种神经发育和精神疾病以及癌症。但是，检测到编辑位点是否意味着功能重要性？人类和转基因小鼠模型中的遗传学研究以及进化基因组学已开始阐明 A-to-I 编辑在体内的作用。此外，最近的发展表明在癌症等病理条件下编辑可能具有不同的功能。
将 CRISPR 扫描与使用双链 DNA 脱氨酶进行靶向染色质可及性分析相结合
基因组编辑可以对内源性顺式调控元件进行序列功能分析，从而推动对其机制的理解和基因疗法的发展。然而，这些方法不能与染色质结构和长单分子染色质纤维可及性的直接可扩展读数相结合。在这里，我们利用双链 DNA 胞嘧啶脱氨酶通过靶向 PCR 和长读测序以高深度和分辨率分析内源性目标基因座的染色质可及性，我们将这种方法称为靶向脱氨酶可及染色质测序 (TDAC-seq)。TDAC-seq 凭借目标基因座的高序列覆盖率，可以与 CRISPR 扰动独特地整合，从而实现顺式调控元件的功能解剖，其中遗传扰动及其对染色质可及性的影响叠加在同一单个染色质纤维上并以单核苷酸分辨率解析。我们利用 TDAC-seq 解析了在红细胞分化过程中激活人类 CD34+ 造血干细胞和祖细胞中胎儿血红蛋白的 CRISPR 编辑，以及在合并的 CRISPR 和碱基编辑筛选中平铺控制珠蛋白位点的增强子。总之，TDAC-seq 能够通过基因组编辑实现单分子染色质纤维的高分辨率序列功能映射。
PDF：在镍和镉胁迫条件下，植物生长指标上局部合成 ACC 脱氨酶的细菌的测定
评估从重金属污染土壤中分离出的 26 种细菌产生 1-氨基环丙烷-1-羧酸 (ACC) 脱氨酶的能力，证实了它们在减少重金属胁迫条件下的重要作用。26 种细菌分离株中有 8 种对 ACC 脱氨酶的产生呈阳性。分离株 #11 通过产生 α-酮丁酸 (102 µM/mg 蛋白质/小时) 具有最高的酶活性。此外，具有多种有利特性的 ACC 脱氨酶产生、根部定植、非致病性细菌也是选择，包括地衣芽孢杆菌 10 (#10)、铜绿假单胞菌 18 (#18)、肠杆菌 11Uz (#11) 和阴沟肠杆菌 Uz_5 (#5)。用悬浮液 #11 处理小麦品种“Chillaki”种子，在金属胁迫条件下，种子发芽率和生长强度 (22%) 显著提高。在严重金属胁迫下生长的植物经悬浮液 #11 处理后，结果显示与对照处理相比，植物生长指标和总叶绿素含量显著改善。此外，在小麦种子中，用肠杆菌 11Uz 悬浮液处理后，脯氨酸、过氧化氢酶和 SOD 活性上升。结果支持使用 ACC 脱氨酶产生肠杆菌 11Uz (#11) 来减轻压力，因为它可以通过其抗氧化系统保护小麦植物免受重金属胁迫。关键词：本地细菌、小麦种子、金属胁迫条件、ACC 脱氨酶、肠杆菌、抗性、脯氨酸、SOD、CAT、发芽率、生长强度 主要发现：具有植物生长刺激特性的 ACC 脱氨酶合成细菌对镍和镉阳离子表现出最高的抗性。选择细菌成功研究了在镍和镉胁迫条件下生长的小麦植株的形态特征和叶绿素含量。细菌在缓解镍和镉胁迫条件方面表现突出。
使用工程化的 CRISPR RNA 引导胞苷脱氨酶对结核分枝杆菌进行可编程碱基编辑
耐多药结核分枝杆菌 ( Mtb ) 感染严重危害全球人类健康，迫切需要新的治疗策略。高效的基因组编辑工具有助于识别参与细菌生理、发病机制和耐药机制的关键基因和途径，从而有助于开发耐药结核病的新疗法。在这里，我们报告了一个双质粒系统 MtbCBE，用于灭活基因并在 Mtb 中引入点突变。在该系统中，辅助质粒 pRecX-NucS E107A 表达 RecX 和 NucS E107A 以抑制 RecA 依赖性和 NucS 依赖性的 DNA 修复系统，碱基编辑质粒 pCBE 表达结合胞苷脱氨酶 APOBEC1、Cas9 切口酶 (nCas9) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合蛋白。这两个质粒共同实现了结核分枝杆菌基因组中所需位点处 G:C 到 A:T 碱基对的有效转换。碱基编辑系统的成功开发将有助于阐明结核分枝杆菌致病机理和耐药性的分子机制，并为开发其他微生物的碱基编辑工具提供重要启发。
使用 Cas9 - 腺嘌呤脱氨酶融合在细菌中进行可编程腺嘌呤脱氨†
系统已被探索作为有效的选择剂来消除未编辑的细胞，从而大大简化了细菌中的基因操作过程。9尽管基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑方法简单且高效，但它们仍然依赖于细菌中的 HR 来实现精确的基因操作，因此难以在某些缺乏强大 HR 系统的细菌（如结核分枝杆菌）中建立。最近，脱氨酶介导的碱基编辑系统的发展为生物学中的精确基因操作提供了新策略。10 – 12碱基编辑系统使用脱氨反应和随后的 DNA 复制过程直接转换目标碱基，而不是前面提到的基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑方法中所利用的 HR。已经建立了两种主要类型的碱基编辑系统：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）10,11 和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。 12,13 CBE 已广泛用于各种生物体（包括真核生物 10,11,14 - 17 和一些细菌物种 17 - 22）中的可编程胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化，而 ABE 主要在真核生物中建立，例如哺乳动物细胞 12,23 和植物 24,25，用于精确的腺嘌呤到鸟嘌呤的转化。最近，在链霉菌中开发了一种名为 CRISPR-aBEST 的 ABE 系统。13 此外，还开发了可编程的腺苷到肌苷和胞苷到尿苷的 RNA 编辑器。26,27
中尺度 DNA 特征影响 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性并塑造肿瘤突变景观
抗病毒 DNA 胞嘧啶脱氨酶 APOBEC3A 和 APOBEC3B 是癌症突变的主要来源，它们催化胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。APOBEC3A 优先靶向单链 DNA，对采用茎环二级结构的 DNA 区域具有明显的亲和力。然而，APOBEC3A 和 APOBEC3B 的详细底物偏好尚未完全确定，DNA 序列对 APO-BEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性的具体影响仍有待研究。在这里，我们发现 APOBEC3B 也选择性地靶向 DNA 茎环结构，它们与 APOBEC3A 脱氨的结构不同。我们开发了 Oligo-seq，这是一种基于体外测序的方法，用于识别促进 APOBEC3A 和 APOBEC3B 活性的特定序列环境。通过这种方法，我们证明了 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性受到目标胞嘧啶周围特定序列的强烈调控。此外，我们还确定了 APOBEC3B 和 APOBEC3A 的结构特征，这些特征决定了它们的底物偏好。重要的是，我们确定了肿瘤基因组内发夹形成序列中 APOBEC3B 诱导的突变与 APOBEC3A 突变的 DNA 茎环序列不同。总之，我们的研究提供了证据，表明 APOBEC3A 和 APOBEC3B 可以在癌症基因组中产生不同的突变景观，这是由它们独特的底物选择性驱动的。
使用切口酶进行选择性线粒体 DNA 碱基编辑
线粒体内膜的物理和化学特性对常用于核基因组碱基编辑的CRISPR系统提出了挑战，因为其向导RNA不能轻易进入线粒体来编辑线粒体DNA（mtDNA）1。此外，之前鉴定的DNA脱氨酶主要针对单链DNA（ssDNA），这限制了它们在线粒体DNA碱基编辑器的开发中的应用。然而，可以修饰双链DNA（dsDNA）中胞嘧啶的DddA脱氨酶的发现，使得开发线粒体DNA碱基编辑器成为可能，例如DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）和转录激活因子样效应物（TALE）连接的脱氨酶（TALED）2,3。这些工具依赖于 DddA，但受到其序列偏好以及通过与转录抑制因子 CTCF 4 相互作用对核基因组产生脱靶效应的风险的限制。此外，DdCBE 和 TALED 会编辑目标序列的两条链 2 , 3 ，从而导致不准确。这些限制阻碍了这些工具在研究和治疗由线粒体DNA突变引起的疾病中的应用。