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实现即时护理脑肿瘤分类：福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 病理的纳米孔甲基化测序
摘要 基于牛津纳米孔技术 (ONT) 的甲基化测序因其快速准确地对脑肿瘤进行分类而受到越来越多的认可。这一过程对于最佳患者治疗至关重要。然而，目前广泛的临床应用受到对新鲜冷冻活检的需求而不是标准福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本的限制。我们的研究探讨了 FFPE 对 DNA 甲基化的影响，并提出了一种基于 ONT 的 FFPE 肿瘤分类的开发和验证方案。我们提出了一种实用的解决方案，用于在常规临床环境中精确诊断脑肿瘤，并在护理点及时做出治疗决策，而不会干扰手术室标准。关键词：肿瘤分类、牛津纳米孔技术、表观遗传分析、DNA 甲基化、FFPE 活检样本、中枢神经系统肿瘤、精准医学、病理学。准确分类肿瘤类型和亚型对于促进全面精准的患者治疗至关重要 1-3 。例如，世界卫生组织 (WHO) 对中枢神经系统 (CNS) 肿瘤的分类涵盖 10 多个主要肿瘤类别，每个类别又包含许多亚类，总共有 100 多个不同的实体，需要不同的治疗方法，并且与不同的预后和临床病程相关 4。这些肿瘤实体在形态、空间和遗传特征上经常表现出相似性 5–7，因此难以区分它们。此外，神经病理学家可能会对组织病理学结果提供不同的解释，这增加了该过程的主观性 8。另一方面，表观遗传学，特别是 DNA 甲基化——已被证明是一种强大而稳定的工具，可准确区分绝大多数这些肿瘤亚型 2，因此基于甲基化的分类已纳入 2021 年 WHO 对 CNS 肿瘤的分类 4。因此，检查肿瘤甲基化模式最近已成为临床诊断程序的一部分，基于甲基化的分类器已经可用于中枢神经系统肿瘤和肉瘤，其他用于不同肿瘤类型的分类器正在开发中 9 。然而，将 DNA 甲基化纳入脑肿瘤的诊断检查已被证明具有挑战性。评估这些甲基化模式的“金标准”方法是 DNA 杂交阵列，例如 Infinium MethylationEPIC 阵列 10 ，但它具有明显的缺点，包括费用高、周转时间长、所需起始材料量大（最低 500ng DNA，最好是 1ug DNA），需要积累多个样本才能获得结果，并且需要训练有素的人员，这与临床需求通常要求的短时间范围不符 。
筛查，鉴定和优化来自萨马林达，东卡利曼丹的少年矿山池的硫氧化细菌，
这项研究是针对潜在的硫酸氧化细菌（SOB）的隔离，筛选，鉴定和培养条件优化（pH，温度，硫代硫酸盐浓度和孵育期），以降低位于东部Kalimantan，Indsanantan，Indsanantan，Indsaneaia的Samarinda的各种AGES水中硫后矿山中的硫浓度。这项研究中使用的池塘为池塘<5岁，> 20岁。获得的75种细菌分离株获得的研究可以增加硫代硫酸盐肉汤培养基的pH值。在九种细菌分离株中，三个分离株KT1.8，KT1.9和KT1.13具有降低硫浓度的培养基浓度的最高效力，为6％，148％和101％。基于16S rDNA序列的相似性，KT1.8，KT1.9和KT1.13分离株被鉴定为Priestia Qingshengii HLS-7（98.9％），辛基菌Siyangensis ds48（97.6％）（97.6％）和PSEUDOMONAS PUTIDASOMONAS PUTISAS CFIDASCFIDASCFIDASCFIDASCFBBBBENSISSISSISSISSISSISSISSISSISSISSISSISIS。随着Kt1.8 = 146x10 14细胞/mL的生长，在30°C温度下，在30°C温度下，在pH 6的三个潜在SOB分离株在30°C的温度下生长更好。 kt1.9 = 81x10 7单元/ml;和kt1.13 = 33x10 7 cell/ml;硫浓度降低KT1.8 = 43.57％； KT1.9 = 43.57％；和KT1.13 = 42.48％。在包含
热碱性裂解GDNA从福尔马林固定的档案组织提取
福尔马林对自然史标本和组织病理学材料的固定历史上一直被视为成功基因组分析的障碍。然而，专门定制的提取方法的开发是与重度交联的档案构成抗衡的，将数百万先前被忽视的标本重新连接为可行的分子资产。在这里，我们提出了一种易于遵循的方案，用于筛选档案湿标本，用于分子活力和随后的基因组DNA提取，适合测序。该协议始于对标本降解和保存介质条件的非破坏性评估，使博物馆策展人和研究人员都可以选择在短阅读DNA测序期间最有可能产生可接受的比例（20-60％）的内源性DNA的标本。提取方案在缓冲液中使用热碱性裂解（0.1M NaOH，1％SDS，pH 13），同时裂解组织并脱离组织。为了最大程度地提高DNA恢复，苯酚：氯仿提取与小碎片优化的Spri Bead清洁结合。适用于保存完好的档案组织，该方案可以产生每50 mg组织的1-2μgDNA，其平均碎片大小通常在50-150 bp的范围内，该尺寸适合恢复足以恢复足够的基因组DNA，足以重建完整的线粒体基因组并获得高达25X核基因组的覆盖率。我们提供了向参考基因组读取映射的指导，并讨论了依靠小片段进行SNP基因分型和从头基因组组装的局限性。该协议为历史标本的更广泛的遗传和系统发育分析打开了大门，有助于更深入地了解进化趋势和适应性，以响应不断变化的环境。
全渠道集成策略 了解农村地区的糖尿病自我保健行为：2型糖尿病和医疗保健专业人员的观点 空气湿度对生物溶质中不同代理的坚韧性的影响 热碱性裂解GDNA从福尔马林固定的档案组织提取 降血糖事件与2型糖尿病患者的认知障碍的关联：剂量反应荟萃分析的方案 关于口吃神经生物学的已知和未知数 医疗保健专业人员的动机沟通培训计划支持糖尿病足溃疡患者的依从性：概念验证研究 心力衰竭患者高压氧疗法的安全性：一项回顾性队列研究 在随机需求和关税条件下的跨境双通道供应链决策 小儿1型糖尿病患者的自我保健活动 宿主特异性细菌和线粒体DNA标记的性能评估和应用，以鉴定日本河水中粪便污染的来源 孟加拉国2型糖尿病患病率和决定因素的农村和城市差异
技术创新和消费者偏好的升级极大地加速了“新零售”全渠道模型的快速发展。满足消费者期望的个性化和无缝的互动体验，需要整合离线和在线渠道的优势，并扩展集成和智能的全渠道布局。这已经成为一个迫切需要解决的复杂问题。为了解决此问题，我们对离线商店和电子商务部门之间的购买店内和店内定价游戏进行了研究，考虑到诸如匹配概率和网络回报成本之类的因素。更重要的是，我们提出了在此策略下的店内和返回（BORO）策略（BORO）策略（BORO）策略，并对离线商店和电子商务部门的市场份额和收入水平的差异进行了分析。结果是：（i）仅在距离成本中等时，BOPS的全渠道战略才能增加离线商店和电子商务部门的收入； （ii）与电子商务部门相比，Boro战略为离线商店提供了更大的好处； （iii）Boro策略的有效性受匹配概率，距离成本和产品回报等因素的影响。这项研究不仅为全渠道品牌商人的战略渠道管理提供了理论基础，还提供了实用的见解。
从存档的福尔马林固定石蜡嵌入的组织产生高质量DNA和RNA的方案开发
方法：就本研究而言，来自肺，肝，结肠和肾脏的人FFPE活检组织是从单个中心的生物座席中获得的。基因喷气基因组DNA纯化试剂盒（目录＃K0722）从Thermo Fisher Scientific和Recocousal kecouseall总核酸分离试剂盒中获得了从生活技术中获得的总核酸分离试剂盒，并分别用于提取DNA和RNA。简要地，修改涉及扩展试剂孵育时间，增加样品体积和洗涤步骤，并增加最终核酸的恢复和浓度步骤。将每个组织样品的8-10μm厚约8-10μm，并用于提取。使用纳米体分光光度计验证了获得的核酸的纯度。
一种有效，易于使用的方法，用于从福尔马林固定和石蜡包裹的胃组织中提取幽门螺杆菌DNA
福尔马蛋白固定石蜡包裹的（FFPE）组织作为活检或通过手术切除，代表了遗传信息的宝贵来源（1，2）。使用此类样品的主要优点是将患者的遗传分析结果与临床疾病的遗传分析结果相关联（3，4）。此外，比较了过去对一名患者的样品的分子研究结果和当前时间可以提供重要数据，以显示疾病的发育或严重程度的趋势（5）。尽管如此，由于最初采样后几年通常收集了后续临床信息，因此用于制备和存储存档标本的程序的详细信息不容易到达，甚至可能未知（6，7）。因此，归档标本的处理，例如提取
新鲜和冷冻的心脏组织在DNA甲基化阵列β值中是可比的，但是福尔马林固定的石蜡包含的组织可能高估了DNA甲基化水平
未处理的新鲜心脏组织是研究心脏生物学和疾病的DNA甲基化模式的最佳组织材料。但是，很难获得新鲜组织。因此，以冷冻或福尔马林固定的，石蜡填充（FFPE）存储的组织被广泛用于DNA甲基化研究。尚不清楚存储条件是否改变心脏组织中的DNA甲基化。在这项研究中，我们比较了新鲜，冷冻和FFPE心脏组织的DNA甲基化模式，以研究储存方法是否影响DNA甲基化结果。，我们使用甲基化甲基化测定法获得了来自九个个体的新鲜，冷冻和FFPE组织中的全基因组甲基化水平。我们发现，与新鲜和冷冻的组织相比，在FFPE样品中，在FFPE样品中高估了21.4％的DNA甲基化水平，而5.7％被低估了。对DNA甲基化模式的重复分析显示了冷冻和FFPE组织的高可重现性（精度）。总而言之，我们发现冷冻和FFPE组织给出了可再现的DNA甲基化结果，并且冷冻和新鲜组织产生了相似的结果。
福尔马林固定石蜡嵌入心脏组织分析的方法
在FFPE过程中，通过交联蛋白保留了组织样品，然后将其嵌入石蜡蜡块中，从而可以轻松切割适合的切片，以安装在显微镜载玻片上进行检查。对于这个实验室，组织是普渡大学研究人员的FFPE。对于他们的方法，从鼠模型中获取了短轴心脏梗塞样品。切除后立即将组织浸入10％中性缓冲甲醛的溶液中。这种浸入过程发生24小时。在此过程中组织变硬。使用70％乙醇洗涤的组织脱水的组织。洗涤后，样品被嵌入石蜡中。重要的是要适当地脱水，并且鉴于要固定的24小时，否则将无法保留组织。然后通过邮件将这些样本发送到田纳西大学，在那里使用各种准备方法为MALDI-MSI的样本做准备[10,11]。
福尔马林固定石蜡的DNA质量评估 -
竖立的福尔马林固定和石蜡包裹的（FFPE）心脏组织来自载体个体是研究死者个体心脏组织的DNA甲基化的重要资源。可能会降低尸检中FFPE组织的DNA质量，从而影响DNA甲基化测量值。因此，估计DNA质量的廉价筛选方法很有价值。研究了使用Illumina Infinium Infinium HD FFPE QC分析（Infinium QC）和Thermo Fisher的Tormo Fisher量化三重量DNA定量试剂盒（分别用探测器量）和Thermo Fisher的量化量（分别概率的DNA限制）（分别概率的DNA甲基化量），研究了（Infinium QC）和Thermo Fisher的量化量（分别对DNA甲基化的量），研究了（Infinium QC）和Thermo Fisher的量化量的DNA心脏组织的DNA质量，并分别进行DNA量化。无甲基化阵列。我们观察到量化剂量降解指数，di和用芝麻分析的可用DNA甲基化数据的量之间存在很高的相关性（r 2 = 0.75; p <10 -11），而观察到较弱的相关性，而Infinium QC和sesame Prome probe dr dr（r 2 = 0.17; p 基于结果，Quantifilertrio di似乎预测了通过线性模型用Illumina Infinium Infinium甲基化阵列和芝麻分析的可用DNA甲基化数据的比例：芝麻探针DR = 0.80 – LOG 10（di）×0.25。基于结果，Quantifilertrio di似乎预测了通过线性模型用Illumina Infinium Infinium甲基化阵列和芝麻分析的可用DNA甲基化数据的比例：芝麻探针DR = 0.80 – LOG 10（di）×0.25。
