ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶是一种融合蛋白,由增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 和来自化脓性链球菌的野生型 Cas9 重组蛋白组成;它包含一个 C 端连接的 eGFP 分子。ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶需要与向导 RNA(例如 ArciTect™ sgRNA(目录号 #200-0013)或由 ArciTect™ tracrRNA(目录号 #76016)和 ArciTect™ crRNA(目录号 #76010)组成的双链)结合,以形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。该 RNP 复合物在基因组中的位点特定位置产生双链断裂。 ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶还在 N 端含有核定位信号,确保 RNP 复合物转位至细胞核,从而提高基因组编辑的效率。由于 RNP 复合物在转染后完全发挥作用,因此在转位至细胞核后可立即发挥作用。RNP 复合物在 48 小时内降解,为基因组编辑提供了充足的时间,同时减少了 RNP 复合物持续存在可能导致的脱靶效应。使用 RNP 系统还可以避免生成稳定的 Cas9 表达细胞系的繁琐过程,从而节省时间并降低由于可诱导表达系统泄漏而导致脱靶效应的风险。化脓性链球菌 Cas9 使用原间隔区相邻基序 (PAM) 序列 NGG(其中 N 可以是任何核苷酸)。如果靶序列下游没有基因组 PAM 位点,酶就不会裂解。
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( A )使用ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 或 CD3 / CD28 / CD2 T 细胞激活活化剂人 T 2 - 3 天后,通过将 TCR αβ 和 CD3 受体与抗体结合,进行流式分析,来测定 TRAC 的敲除效率。每个条件的每个数据点代表一个单独的供体;n = 4 - 8 个供体。每一列线路表示干±标准差。( B ) )首先人T细胞被ImmunoCult™人CD3 / CD28 T细胞剂激活活化剂3天,然后进行电转。在电转48小时后,通过ArciTect™ T7循环内切酶I试剂盒测定基因组编辑(切割)的效率。 RNP 电转:+ RNP 。( C - D )被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细细胞激活剂活化 3 天的人 T 细胞经( C )模拟电转(无 RNP )和( D ) RNP 电转后 TCR αβ 和 CD3 的流式分析点图。( E )被ImmunoCult™ 人 CD3 / CD28 T 细胞激活剂活化 3 天的人 T细胞的CD4和CD8流式分析点图。