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使用 Benchling 教程设计 gRNA：Myriam Sévigny 撰写，2022 年基因组生物学单元由 HiLIFE 和赫尔大学医学院支持
• 对于基因敲除，gRNA 通常靶向 5' 组成性表达的外显子，这降低了由于可变剪接而从 mRNA 中移除目标区域的可能性。 • 根据经验，避免靶向编码蛋白质 N' 末端附近氨基酸的位点，以减轻细胞使用注释起始密码子下游的替代 ATG 的能力。同样，避免靶向编码蛋白质 C' 末端附近氨基酸的位点，以最大限度地增加产生无功能等位基因的机会。对于 1 千碱基基因，由于潜在靶向位点每 8 个核苷酸中出现约 1 个，将 gRNA 限制在蛋白质编码区域的 5 – 65% 仍将导致有数十种 gRNA 可供选择。有这么多可能性，选择具有优化序列的 gRNA 是首要任务。 • 如果可能，设计 gRNA 以靶向编码已知必需蛋白质结构域的外显子。这种方法的好处是，即使非移码等位基因在重要的蛋白质结构域中出现时也可能改变蛋白质的功能。
Jackie Brunson，Adrienne Cooley，Ansley Montgomery，...Jackie Brunson，Adrienne Cooley，Ansley Montgomery，...
图2。描述研究方法。根据长凳得分选择了两个CRISPR/CAS9指南，并注入斑马鱼。PCR和凝胶电泳评估了它们的DNA切割有效性。36小时后，去除死胚，观察到活的胚胎。在80小时时，对剩余的鱼进行了表型分析，并比较了微动物测定。每个指南五个胚胎进行了DNA测序以检测变化。
六个基本数字能力加速细胞和基因治疗R＆D
每个专注于细胞和基因疗法的公司都采用自己的差异化科学策略，从而导致独特的工作流，这些工作流涵盖基因编辑，构造设计，生物处理，体外和体内测试。随着研发团队的成熟科学或选择新的方向，这些工作流程通常会随着时间而变化。因此，确保您的数字基础可以支持整个研发生命周期的现代细胞和基因疗法的广度和复杂性变得至关重要。Benchling在从早期发现到IND及以后的计划中，已经支持了数百家细胞和基因治疗公司。下面的工作流代表了R＆D通常结构的高级抽象，我们将基本功能映射到您经常遇到它们的地方。
CRISPR/Cas12a (Cpf1) 引导RNA序列的鉴定
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）或 CRISPR 相关（Cas）系统已成为一种主要的基因编辑工具。使用 CRISPR 进行基因编辑需要 Cas 蛋白和相应的向导 RNA（gRNA）。然而，低切割效率和脱靶效应会阻碍 CRISPR/Cas 系统的应用。因此，确定特定的 gRNA 至关重要。在生物传感器应用中，由于 Cas12a（Cpf1）的反式切割活性，CRISPR/Cas12a 可以增强识别靶基因的特异性和灵敏度。mtDNA D 环序列是 mtDNA 中最易变的部分，使其适合区分物种。因此，本研究的目的是通过计算机模拟确定野猪 mtDNA D 环的 gRNA 序列。在 GenBank 数据库的帮助下，使用 Benchling 应用程序预测候选 gRNA。随后，使用 BLAST 核苷酸对 gRNA 候选物进行同源性差异分析，并使用 Jalview 进行错配测试。在几个候选物中，候选物 1 被选为最佳选择，脱靶值为 99.8。与竞争对手的同源性差异分析和与 Sus 属的错配测试分别产生了较高的 E 值和较高的百分比值。这表明候选物不会识别其他物种，但可以检测 Sus scrofa 物种的成员。这些 gRNA 候选物可以选择性地且灵敏地应用于生物传感器，以检测肉类掺假。