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使用 Benchling 教程设计 gRNA：Myriam Sévigny 撰写，2022 年基因组生物学单元由 HiLIFE 和赫尔大学医学院支持
• 对于基因敲除，gRNA 通常靶向 5' 组成性表达的外显子，这降低了由于可变剪接而从 mRNA 中移除目标区域的可能性。 • 根据经验，避免靶向编码蛋白质 N' 末端附近氨基酸的位点，以减轻细胞使用注释起始密码子下游的替代 ATG 的能力。同样，避免靶向编码蛋白质 C' 末端附近氨基酸的位点，以最大限度地增加产生无功能等位基因的机会。对于 1 千碱基基因，由于潜在靶向位点每 8 个核苷酸中出现约 1 个，将 gRNA 限制在蛋白质编码区域的 5 – 65% 仍将导致有数十种 gRNA 可供选择。有这么多可能性，选择具有优化序列的 gRNA 是首要任务。 • 如果可能，设计 gRNA 以靶向编码已知必需蛋白质结构域的外显子。这种方法的好处是，即使非移码等位基因在重要的蛋白质结构域中出现时也可能改变蛋白质的功能。