XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemBovine
联合免疫检查点阻滞增强了针对牛白血病病毒的抗病毒免疫力
摘要牛白血病病毒（BLV）是一种逆转录病毒，在牛中引起牛牛白细胞病（EBL），并且在包括日本在内的许多国家 /地区广泛。最近的研究表明，在BLV感染期间，免疫抑制性分子（例如造成的死亡-1（PD-1）和PD-rigand 1）的表达在免疫抑制和疾病进展中起着至关重要的作用。此外，一项初步研究表明，另一种免疫抑制性分子T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3（TIM-3）参与BLV感染期间的免疫抑制。因此，本研究旨在进一步阐明免疫检查点分子在BLV感染中的免疫抑制作用。tim-3表达在BLV感染的牛中外周cD4 1和CD8 1 T细胞上上调。有趣的是，在EBL牛中，CD4 1和CD8 1 T细胞在纤维化淋巴瘤中表达了TIM-3。TIM-3和PD-1在来自BLV感染的牛的外围CD4 1和CD8 1 T细胞中上调并共表达。通过抗牛TIM-3单克隆抗体阻断了T细胞和伽马干扰素（IFN-G）产生的CD69表达，来自BLV感染的牛的外周血单年透明细胞的产生。合成构成测定也证明了TIM-3阻断对BLV感染的抗病毒作用。与仅抑制相比，TIM-3和PD-1途径的综合抑制显着增强了IFN-G产生和抗病毒效率。总而言之，TIM-3和PD-1途径的封闭阻滞显示出强大的免疫激活和抗病毒作用，并且具有作为BLV感染的新型治疗方法的潜力。
以单月桂酸甘油酯为佐剂的牛病毒性腹泻（BVD）病毒灭活疫苗的有效性和持久性
牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 可引起生殖、肠道和呼吸道疾病。接种疫苗对于提高牛群对 BVDV 传播的抵抗力至关重要。佐剂的选择是疫苗接种过程成功的重要因素。单月桂酸甘油酯或甘油单月桂酸酯是一种具有免疫调节作用的安全化合物。本研究旨在评估单月桂酸甘油酯作为新型佐剂的功效。通过制备以不同浓度单月桂酸甘油酯为佐剂的灭活 BVDV (NADL 株) 疫苗进行检查，并与已注册的当地制备的多价疫苗 (Pneumo-4) 进行比较，该疫苗含有 BVD (NADL 株)、BoHV-1 (Abou Hammad 株)、BPI3 (菌株 45) 和 BRSV (菌株 375L)，并以氢氧化铝凝胶为佐剂。灭活的 BVDV 疫苗以 0.5%、1% 和 2% 的单月桂酸甘油酯为佐剂，制备而成。对五组动物进行了效力测试。第一组未接种疫苗，作为对照组，而其他三组则使用制备的疫苗进行接种。第五组接种了 Pneumo-4 疫苗。通过使用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测量病毒中和抗体来监测疫苗接种反应。研究发现，与以氢氧化铝凝胶为佐剂的商业疫苗相比，含有 1% 和 2% 单月桂酸甘油酯的 BVD 灭活疫苗可引发更高的中和抗体，其作用持续时间更长（九个月），且注射部位无反应。
将受精卵注射到牛胚胎中，对自然发生的序列变异进行基因组编辑
基因组编辑通过有针对性地引入天然序列变体，加速遗传增益，为改进当前的牛育种策略提供了机会。这可以通过在修复模板存在的情况下利用编辑器诱导的基因组切割后的同源性定向修复机制来实现。将基因组编辑器引入受精卵并在胚胎中进行编辑的优势在于，活体动物的发育不会受到影响，并且与当代基于胚胎的改良实践保持一致。在我们的研究中，我们调查了引入已知的前黑素体蛋白 17 ( PMEL ) 和催乳素受体 ( PRLR ) 基因的序列变体，并产生完全转化为精确基因型的非嵌合体编辑胚胎的潜力。将 gRNA/Cas9 编辑器注射到牛受精卵中以将 3 bp 缺失变体引入 PMEL 基因，可产生高达 11% 的完全转化胚胎。使用 TALEN 后，转化率提高到 48%，但前提是通过质粒递送。在几种已知 PRLR 序列变体、不同修复模板设计和 DNA、RNA 或核糖核蛋白传递的背景下测试三种 gRNA/Cas9 编辑器，实现了高达 8% 的完全转化率。此外，我们还开发了一种基于活检的非嵌合体胚胎筛选策略，该策略有可能专门生产具有预期精确编辑的非嵌合体动物。
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
杂交牛胚胎中催乳素受体基因外显子11存在多处突变
具有 SLICK 单倍型的牛具有光滑且短的毛发特征，SLICK 单倍型的主要优点之一是其在改善牛的体温调节方面发挥的作用，尤其是在炎热潮湿的气候下。导致牛出现光滑表型的致病变异主要位于催乳素受体基因的第 11 个外显子中，但应注意的是，并非在此区域发现的所有变异都会导致光滑表型（Porto-Neto 等人，Front. Genet.，9:57，2018）。尽管如此，这些单个等位基因对于 CRISPR 实验中的引导设计问题仍然至关重要，特别是那些旨在敲除或修改催乳素受体基因的实验。这些单个等位基因的鉴定有助于更全面地了解该区域的遗传变异，并可帮助研究人员为他们的实验设计更精确、更有效的引导 RNA。因此，即使不直接导致光滑表型的等位基因，在增进我们对与这一基本特征有关的潜在遗传机制的了解方面也具有重要价值。本研究旨在评估体外受精 (IVF) Bos taurus x Bos indicus 杂交牛胚胎的基因组序列，特别关注 PRLR 区域。单独收集囊胚，并使用两步孵育法用蛋白酶 K (1,5ug/uL) 裂解缓冲液进行 DNA 提取。随后，重复进行 PCR 扩增，并对 PCR 片段进行 Sanger 测序。使用 Unipro Ugene 软件进行序列分析 (Okonechnikov K., et al. Bioinformatics, 28 (8):1166-7, 2012)。共分析了 15 个样本，发现 33.3% (5/15) 的样本在位置 39099463 处出现单个突变 (C>T)，导致丝氨酸被替换为终止密码子，这是之前未曾报道过的。此外，在一个位置很近的区域中发现了一对错义突变，60% 的样本在位置 39099322 处出现精氨酸被替换为亮氨酸的突变 (G>T)，而所有样本在位置 39099190 处出现丝氨酸被替换为亮氨酸的突变 (C>T)。最后，在位置 39099368 处发现了一个静默突变，可能导致 60% 的样本中的胞嘧啶被胸腺嘧啶替换，在这两种情况下都会导致酪氨酸的合成。根据初步分析的结果，可以推断该区域具有较高的遗传变异潜力。因此，建议在设计旨在引入插入/缺失以促进光滑表型的向导 RNA 之前，检查杂交动物的目标基因组区域并与 Bos taurus 进行比较。总之，本研究的结果为了解牛 PRLR 区域的遗传变异提供了宝贵的见解，这可能会影响基因编辑效率。
来自苏格兰牛乳腺炎病例的克雷伯氏菌肺炎分离株的抗菌耐药性和分子流行病学
肺炎克雷伯氏菌是机会性病原体，可能导致奶牛乳腺炎。K.肺炎乳腺炎通常的治愈率较差，并且可能导致慢性感染的发展，这对健康和生产都有影响。但是，很少有研究旨在通过牛乳腺炎病例进行全基因组测序来充分表征肺炎。在这里，使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和全基因组测序鉴定出与乳腺炎相关的肺炎分离株与乳腺炎相关的肺炎。此外，全基因组序列数据用于遗传分析，并且都与表型AMR测试并行，均与virulenceandantimicrobial耐药性（AMR）预测。四十二个分离株被鉴定为K.肺炎。进行全基因组测序，观察到31种多层次序列类型，这表明这些分离株的来源可能是环境的。分离株的关键毒力决定因素，编码了获得的铁载体，结肠癌和高胶体。其中大多数是缺乏的，除了YBST（编码Yersiniabactin）以六个分离株存在。在整个数据集中，对链霉素（26.2％）和四环素（19％）的表型AMR水平很明显，以及对头孢霉素（26.2％）和新霉素（21.4％）的中间易感性。的重要性是检测两个产生ESBL的分离株，这些分离株表现出对阿莫西林 - 克拉维酸，链霉素，四环素，头孢霉素，头孢菌素，头孢霉素和头孢菌素的抗性性。
赖氨酸和蛋氨酸对牛乳腺上皮细胞候选转录因子mRNA表达的影响
已确定必需氨基酸 (EAA) 通过快速改变翻译因子的磷酸化状态来调节乳腺上皮细胞的蛋白质合成。然而，对 EAA 供应的长期转录反应研究得很少。选定了八种转录因子作为 EAA 通过氨基酸反应 (ATF4、ATF6)、丝裂原活化蛋白激酶 (JUN、FOS、EGR1) 和雷帕霉素复合物 1 的机制靶点 (MYC、HIF1A、SREBF1) 影响乳腺细胞功能的候选介质。目的是确定在施加 EAA 缺乏 24 小时后，这些候选基因的表达是否以及何时在牛乳腺上皮细胞原代培养物中受到影响，并评估 EAA 缺乏对蛋白质合成、内质网大小、细胞增殖和脂肪形成的影响。将分化细胞在代表所有氨基酸的正常生理浓度 (CTL)、低赖氨酸 (LK) 或低蛋氨酸 (LM) 的 3 种处理培养基中的 1 种中培养 24、40、48 或 60 小时。LK 和 LM 均抑制蛋白质合成并激活 ATF4 表达，表明经典的氨基酸反应途径已被触发。然而，LK 或 LM 对内质网大小没有影响，可能与 LM 上 ATF6 表达升高有关。早期反应基因 JUN 、 FOS 、 EGR1 和 MYC 的表达没有因 EAA 缺乏而升高，但 LM 降低了 EGR1 的表达。LM 还增加了 HIF1A 的表达。EGR1 和 HIF1A 的表达结果与观察到的细胞增殖率下降一致。不同时间点 SREBF1 表达对 LK 和 LM 的不同反应可能导致对脂肪生成率没有影响。这些发现表明，EAA 缺乏可能通过转录因子抑制乳腺蛋白质的合成和细胞增殖。
重组 DNA 疫苗设计作为对抗牛口蹄疫病毒 (FMDV) 的潜在策略
1.1. 分类和命名法 ................................................................................................................ 1 1.2. 基因组组织 ...................................................................................................................... 4 1.3. 病毒生命周期 ................................................................................................................ 5 1.4. 先天免疫的诱导 ................................................................................................................ 8 1.5. 传播和临床症状 ................................................................................................................ 9 1.6. 控制和治疗 ...................................................................................................................... 11 1.7. 检测和血清学检测 ............................................................................................................. 13 1.8. 疫苗接种 ............................................................................................................................. 15 1.9. DNA 成分的优化 ............................................................................................................. 16 1.10. 论证和假设 ................................................................................................................ 21 第 2 章 材料和方法 ................................................................................................................ 24
在手工生产未煮过的牛奶中的未煮熟奶酪的手工生产过程中探索细菌群落
•开胃培养添加降低了奶酪生产的细菌多样性（图1，步骤3）•奶酪洗涤（步骤7）是上游和下游步骤中的细菌群落重叠的步骤（图2）•细菌群落的组成在整个生产过程中都发生了变化（图3）：原乳是高细菌多样性的主导，起动培养物引入导致链球菌和乳酸杆菌的丰度更高，然后成熟的成熟是，corynebacterium and corynebacterium和brevibacterium的丰度增加。应进行进一步的分析，以阐明接触表面微生物群在奶酪生产过程中的精确作用。