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高亲和力 CD16 整合到 CRISPR/Cas9 编辑的 CD38 基因座中可增强原代人类自然杀伤细胞的 CD38 定向抗肿瘤活性
摘要 背景 过继转移具有增强的抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC) 能力和对 CD38 靶向性抗性的自然杀伤 (NK) 细胞有可能增强达雷木单抗 (DARA) 的临床抗骨髓瘤活性。因此，我们试图开发一种有效的基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑平台，以破坏离体扩增的 NK 细胞中的 CD38 表达 (CD38 敲除 (KO))，并同时为 CD38 KO NK 细胞配备高亲和力 CD16 (CD16-158V) 受体。方法 使用 Cas9 核糖核蛋白复合物生成 CD38 KO 人 NK 细胞。通过结合信使 RNA (mRNA) 转染 CD38 KO NK 细胞和在 CD38 位点插入靶向基因以介导基因敲入 (KI)，扩展了该平台。在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中测试了这些基因编辑的 NK 细胞在 DARA 存在下持续存在和介导 ADCC 的能力。结果在体外扩增的 NK 细胞中实现了高效的 CD38 基因破坏，而不会影响其增殖或功能能力。CD38 KO 赋予了对 DARA 诱导的 NK 细胞自相残杀的抗性，在体外和 MM.1S 异种移植小鼠模型中，在 DARA 存在下，能够持续存在并增强对骨髓瘤细胞系的 ADCC。CD38 KO NK 细胞可以通过转染编码 CD16-158V 受体的 mRNA 进一步修饰，从而增强 DARA 介导的 ADCC。最后，我们观察到针对 CD38 基因座的同源定向修复模板促进了有效的 2 合 1 CD38 KO 与截短 CD34 报告基因和 CD16-158V 受体的 KI 结合，CD38 KO /CD16 KI NK 细胞在体外和体内均表现出 DARA 介导的 ADCC 的进一步增强。结论使用体外扩增的 CD38 KO /CD16 KI NK 细胞进行过继免疫治疗有可能提高 DARA 的临床疗效。通过将互补的基因工程策略整合到 CD38 KO 制造平台中，我们生成了具有显著增强的 CD38 定向抗肿瘤活性的 NK 细胞，为在临床上探索这种免疫治疗策略奠定了坚实的基础。
基因工程及其在肿瘤治疗中的进展
淋巴细胞及其亚群，它们广泛参与免疫细胞的抗原识别，细胞粘附和信号转导，并且是一系列重要的生理和病理学过程的分子basis，例如内炎，免疫反应，肿瘤转移，肿瘤转移等[8]。CD3分子是多特异性抗体中最常用的免疫募集效应细胞位点。在多特异性抗体结构中，由TRION Research/Neovii Biotech机构开发的抗原抗原是Epcam/CD3，用于治疗恶性腹水和由Amger机构开发的Bline-tumomab靶向抗原，用于急性淋巴细胞细胞细胞细胞细胞细胞。由Transtarget/Barbara Ann Karmanos癌症研究所开发的抗CD3-ANTI-HER2激活的T细胞目前正在II期临床研究中，靶向抗原HER2/CD3期II期可用于乳腺癌。CD47分子称为整合素相关蛋白。在免疫检查点上抑制CD47可以有效防止肿瘤细胞通过巨噬细胞逃避吞噬作用[9]。目前，针对CD47/CD19和CD47/CD20的多特异性抗体的研究在杀死体内和体外杀死Tu mor方面取得了良好的结果。由CD16在人NK细胞上介导的肿瘤细胞的直接杀死过程取决于溶液受体的质量紧密结合。目前，与CD16相关的多特异性抗体药物研究是由AFFIMED Company开发的AFM-13，该公司目前正在针对CD30/ CD16的II期临床研究中。针对CD19/CD16，EGFRVIII/CD16和EGFRWT/CD16的抗体处于研发阶段。这三种抗体不仅适用于血液学肿瘤，而且还可以靶向一些固体肿瘤[10]。
COVID-19-19 淋巴细胞，单核细胞和低密度（LD）中性粒细胞 现金与彩票：Covid-19-19疫苗激励措施实验* 在基于邻里的疫苗和测试现场的高级父母疫苗动机 SARS-COV-2突破性感染与时间效率 - 疫苗的相关性；初步研究 与免疫介导的炎症性疾病和免疫修饰疗法相关的严重共同互联19结果的风险：一项全国范围的研究 COVID-19疫苗在六家以色列医院（Covehpi）的医疗保健人员中的疫苗有效性 疫苗优先级策略对减轻COVID-19的影响：基于代理的模拟研究使用美国的城市地区 基于功能性MRI和多级功能连通性，用图卷积网络预测脑淀粉样蛋白-βPET表型
•中性粒细胞，单核细胞，T细胞，NKT，NK和B细胞亚型的门控策略； （a）在LD粒细胞，LD中性粒细胞（CD14+ CD16-）（B）CXCR3和HLA-DR测量上的CD14和CD16表达在LD中性粒细胞（C）CD19+ B细胞上，CD19+ B细胞在CD27和CD38和CD38，NAIME B细胞（CD27-CD38+）中（CD27-CD38+）（CD27-CD38+）（CD27-CD38+）（CD27-CD38+）细胞（ （CD27+CD38+）测量。（d）在CD24和CD38上输送的记忆B细胞，显示了概述的过渡B细胞门。（e）在CD24和CD38上门控的幼稚的B细胞，其中CD24+CD38 ++过渡B细胞门控。（f）使用CD14和CD16：CD14+CD16-经典，CD14+CD16+中间体和CD14-CD16-非古典的单核细胞亚型。（G）CD14+单核细胞CXCR3和HLA-DR状态。（H）CD3和CD19用于定义； B细胞（CD19+），T细胞（CD3+）和NBNT（CD19- CD3-）淋巴细胞。（I）定义CD4 T细胞，CD8 T细胞，CD4+CD8+双阳性和CD4-CD8-双阴性T细胞（J）CD56和CD16表达的T细胞的CD4和CD8染色，CD56+NKT和CD16+NKT的T细胞上的CD56和CD16表达。（k）非-B和非T细胞（NBNT）群体显示CD56和CD16的表达，以识别CD56Bright（CD56 ++），NK细胞（CD56+CD16+）和CD56-CD16+NK细胞。（l-r）cxcr3和hla-dr表达； （L）CD4 T细胞（M）CD8 T细胞（N）CD56+ T细胞（O）CD16+ T细胞（P）CD56 ++ NK细胞（Q）CD56+ CD16+ CD16+ NK细胞（R）CD56-CD16+ NK细胞。（S-W）CD27和CD38的表达； （S）CD4-CD8-DN T细胞（T）CD4 T细胞（U）CD8 T细胞（V）CD56+ T细胞（W）CD16+ T细胞。CD4和CD8在（x）CD56+ T细胞（y）CD16+ T细胞上的表达。CD4和CD8在（x）CD56+ T细胞（y）CD16+ T细胞上的表达。
701。实验移植：基本和翻译
图4。交叉反应性以及对人和cynomolgus猴子靶标的体外生物活性。（a）KD值通过表面播种共振测量。（b）通过CYNO CD16 +或人类CD56 + CD16 +效应细胞从人类供体中动员细胞中CD34 +动员细胞的体外杀死。图显示了在MP0621存在的情况下以E：T比5：1的24 h共培养时的靶细胞裂解。两个独立实验的代表性示例。（c）使用工程设计的目标细胞测量CD47的CKIT依赖性条件阻滞，以表达cynomolgus猴子CKIT和/或CD47（CHO-CKIT/CCD47或CHO-CCD47或CHO-CCD47）或CHO CHO细胞表达人类靶标（CHO-HCKIT/HCKIT/HCKD/HCD47或CHO-HCD47）。与MP0621和洗涤孵育后，将生物素化的α-CD47检测剂添加到细胞中，然后将链霉亲和素AF647添加到细胞中。获得的信号反映了细胞表面上可用的游离CD47的水平。
激光针灸生物刺激后脑瘫儿童的免疫指数改善了
最常见的疾病之一是严重神经疾病的原因是脑瘫（CP）。CP全球患病率是每1000个活产的平均1-4。研究的目的是确认激光针灸治疗对通过升高的NK细胞计数改善痉挛性CP儿童免疫指数的影响。来自国家激光增强科学研究所儿科门诊诊所（NILES）和Benha Fever医院的物理治疗门诊诊所，招募了40名痉挛性CP的儿童，年龄在1至3岁之间，招募了两种性别。它们被随机分为两组：A组（对照组）的物理治疗课程每周一小时，每周三次，总计12周。除了定期的身体治疗外，B组（研究组）的参与者还接受了780 nm二极管激光针灸，每周三次输出功率为50 mW，总共12个疗程。两组中的所有儿童的NK细胞（CD16 CD56）通过使用“ BD FACSCALIBUR”在处理前后的“ BD FACSCALIBUR”的流式细胞仪测量。对数据进行了统计测试。在治疗后A组和B组之间NK细胞的计数（CD16，CD56）显着差异，而B组的总数较高。 这项研究的结果表明，在接受激光针灸治疗后，痉挛性CP儿童的NK细胞数量增加。在治疗后A组和B组之间NK细胞的计数（CD16，CD56）显着差异，而B组的总数较高。这项研究的结果表明，在接受激光针灸治疗后，痉挛性CP儿童的NK细胞数量增加。
EDIT-202，一种多路复用 CRISPR-Cas12a 基因......
• 使用 SLEEK ™ 方法，用工程化的 AsCas12a 编辑 iPSC，敲入 CD16 和 mbIL-15。3 同时，还用 AsCas12a 编辑 iPSC，敲除 CISH 和 TGFβR2。然后将 iPSC 克隆分化为 iNK 细胞。流式细胞术证明 DKI iNK 细胞表面表达 CD16 和 mbIL-15。• 使用 Incucyte ® 成像 NucLight Red 标记的 SK-OV-3 细胞进行 3D 肿瘤球体杀伤试验，以评估 iNK 细胞的细胞毒性。通过在基础培养基中培养野生型 (WT) 和 DKI iNK 细胞 21 天（不含支持细胞因子）来测量体外持久性。 • 非肥胖糖尿病 (NOD) 严重联合免疫缺陷 (scid) γ (NSG) 小鼠接种 0.25x 10 6 荧光素酶 (luc) 表达 SKOV-3 细胞系 (SKOV-3-luc) 卵巢肿瘤细胞。小鼠接受单次腹膜内 (IP) 剂量 500 万 WT iNK 或 EDIT-202 细胞，多次 IP 剂量 2.5 mg/kg 曲妥珠单抗 (TRA)。使用 Perkin Elmer 生物发光体内成像系统 (IVIS) 计算肿瘤负荷。披露
XMT-2056，一种指导的刺痛激动剂抗体-Drug ...
在这里，我们证明了XMT-2056表现出ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）功能，该功能随着STING途径的激活而协同，并诱导HER2表达癌细胞和FCγ-RIII +（CD16 + CD16 +）的HER2表达癌细胞中有效的癌细胞细胞活性。我们表明，XMT-2056和HT-19（未结合的父母抗HER2抗体）在FC效应的功能中保留了在PBMC共培养中以Fcγ-RI-Expectress Expectress Expectress Expectress的髓样细胞耗尽的PBMC共培养中的重要癌细胞杀死活性。通过Fcγ-RIII +免疫细胞的共排除，该活性消除了，这说明了XMT-2056的ADCC功能。在这种情况下，与HT-19相比，XMT-2056癌细胞杀伤活性显着增加，这表明刺痛激动剂有效载荷有助于对XMT-2056治疗观察到的差异活动。的确，癌细胞和免疫细胞与HT-19的共同培养和自由刺痛激动剂有效载荷共同培养增强了抗肿瘤反应，尽管其程度较小，而不是XMT-2056，这表明ADCC函数和Sting途径激活之间的协同作用。
双特异性抗体
行动机制 - 它们如何工作？双特异性抗体（BSABS）是一种新的免疫疗法药物（使用人体免疫系统来对抗癌症的药物），旨在识别在细胞表面上表达的两个不同靶标，称为抗原。这些药物可以静脉注射（直接注入静脉）或皮下（皮肤下方）。在血液中，BSABS会在整个体内传播，并将自己固定在具有特定抗原的细胞上。根据其作用机理（药物如何在体内产生影响），这些药物可以分为细胞桥接的BSAB（最常用的）和抗原交联的BSAB。细胞桥接的BSAB与癌细胞的一种抗原结合（例如，CD20或CD19在B细胞淋巴瘤中）和一种来自健康免疫细胞的抗原（例如 CD3在T细胞中或自然杀伤中的CD16中的CD1）。 相反，抗原交联BSAB与同一细胞中的两个抗原结合。CD20或CD19在B细胞淋巴瘤中）和一种来自健康免疫细胞的抗原（例如CD3在T细胞中或自然杀伤中的CD16中的CD1）。相反，抗原交联BSAB与同一细胞中的两个抗原结合。
海报 2780
• 自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫系统的强大效应器，可以直接识别和杀死肿瘤细胞，因此使其成为癌症细胞疗法的有吸引力的选择。 • 由于 NK 细胞存活所需的关键细胞因子（例如白细胞介素 15 (IL-15)）水平低，以及肿瘤内在免疫抑制机制（例如肿瘤微环境中高水平的转化生长因子 β (TGFβ)）缺乏持久性，导致 NK 细胞效力降低。1 此外，当 NK 细胞活化后 CD16 被切割时，NK 细胞发挥抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的能力会受损。2 Editas 专有的基于 AsCas12a 的基因编辑方法用于修改 iNK 细胞，以克服这些生物学限制并增强 NK 细胞功能。 • 我们假设，细胞因子诱导的 SH2 蛋白 (CISH) 基因（IL-2/IL-15 信号的负调节剂）和 TGFβ 受体 2 (TGFβR2) 基因的 DKO 会改善 NK 细胞效应功能，并使其对 TGFβ 介导的抑制产生抵抗力。此外，我们假设，膜结合 IL-15 (mbIL-15) 和 CD16 进入 NK 细胞的 DKI 会延长 NK 持久性，并在与 ADCC 诱导的肿瘤靶向抗体（如曲妥珠单抗）结合时增加细胞毒性。
EDIT-202，一种 AsCas12a 和 SLEEK™ 基因编辑的 iPSC-...
• 与 WT iNK 细胞相比，EDIT-202 的 CD16 和 mbIL-15 水平明显更高，表明我们的 SLEEK ™ 技术是一种强大的编辑 iPSC 方法。 • 与 WT iNK 细胞相比，EDIT-202 在体外具有更长时间的细胞因子非依赖性持久性，表明 EDIT-202 细胞中的 mbIL-15 敲入足以维持生存和维持。 • EDIT-202 对卵巢 SKOV-3、头颈部 FaDu 和肺腺癌 A549 肿瘤细胞表现出明显更高的 ADCC 介导细胞毒性。活化的 EDIT-202 诱导的 IFN-γ 水平明显更高。 • 与 WT iNK 细胞相比，EDIT-202 细胞在暴露于肿瘤后上调并持续表达 CD16，这使这些细胞能够显着诱导对 SKOV-3 肿瘤细胞的连续杀伤。 EDIT-202 的连续杀伤能力在存在免疫抑制 TGF-β 的情况下不受影响。• 在体内 SKOV-3-luc 实体瘤模型中，与仅使用 TRA 相比，EDIT-202 + TRA 治疗可显著降低肺肿瘤负担，并导致多只小鼠的肿瘤完全清除。• 与 TRA 结合使用时，EDIT-202 在实体瘤 SKOV-3 模型中比仅使用 TRA 治疗显著提高了存活率。在第 100 天，15 × 10 6 只接受 EDIT-202 + TRA 治疗的小鼠中 100% 存活，而仅使用 TRA 治疗的小鼠存活率为 0%。• 这些数据支持将 EDIT-202 开发为一种用于治疗实体瘤的潜在同种异体细胞药物。