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CREditing：克氏锥虫基因调节工具
克氏锥虫的基因操作仍然是一个挑战，主要是因为缺乏可用且有效的分子工具。CRE-lox 重组系统是一种位点特异性重组酶技术，是一种广泛用于实现染色体或游离 DNA 中的条件性靶向缺失、倒位、插入、基因激活、易位和其他修饰的方法。在本研究中，CRE-lox 系统经过改进，以扩展当前用于这种难以操作的寄生虫的基因工具箱。为此，我们评估了通过电穿孔直接蛋白质递送 CRE 重组酶是否可以改善克氏锥虫中 CRE 介导的重组。CRE 重组酶与克氏锥虫组蛋白 H2B 的 C 端融合，H2B 携带核定位信号并在原核系统中表达。融合蛋白经过亲和纯化后直接引入上鞭毛体和组织培养衍生的锥虫中。这可以控制基因表达，如通过打开先前转染到寄生虫中的串联二聚体荧光蛋白报告基因所证实的，在高达 85% 的寄生虫中实现了 CRE 介导的重组。进一步测试了该系统关闭基因表达、去除整合到基因组中的可选择标记以及有条件地敲除与耐药性有关的硝基还原酶基因的能力。此外，CREditing 还可以控制组织培养锥虫中的基因表达，而锥虫比上鞭毛体更难转染。本研究中显示的克氏锥虫基因组操作的重大进展可供其他人使用，以帮助通过获得或丧失功能的方法更好地了解这种寄生虫。 2020 澳大利亚寄生虫学会。由 Elsevier Ltd. 出版。保留所有权利。
针对克氏锥虫的基因编辑策略
深入探索基因编辑的革命性世界，特别关注原生动物克氏锥虫，即查加斯病的病原体。这次关键会议旨在让来自拉丁美洲国家的学生掌握最新基因编辑技术的尖端知识和技能，包括突破性的 CRISPR-Cas9 系统。将有机会进行海报展示并与外国专家交流。主题包括：
基于 CRISPR/Cas9 核糖开关的克氏锥虫基因表达下调方法
在最近引入 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除、基因敲入、基因补充和内源基因标记之前，很少有基因工具可用于研究克氏锥虫。核糖开关是天然存在的自裂解 RNA（核酶），可被配体激活。我们实验室最近的研究结果证明了枯草芽孢杆菌中的 glmS 核酶可用于布氏锥虫的基因沉默，该核酶已被证明可控制响应外源葡萄糖胺的报告基因表达。在这项工作中，我们使用 CRISPR/Cas9 系统用活性（glmS）或非活性（M9）核酶对克氏锥虫糖蛋白 72（TcGP72）和液泡质子焦磷酸酶（TcVP1）进行内源性标记。通过 PCR 确认基因标记，并通过蛋白质印迹分析验证蛋白质下调。通过免疫荧光分析和体外生长定量进行进一步的表型表征。我们的结果表明，该方法成功地抑制了两种基因的表达，而无需培养基中的葡萄糖胺，这表明克氏锥虫在正常生长条件下产生足够水平的内源性葡萄糖胺 6-磷酸来刺激 glmS 核酶活性。该方法可用于敲除克氏锥虫中的必需基因并验证这种寄生虫中的潜在药物靶点。
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Andrade，S。G。Caracterizaçãodecepas de trypanosoma cruzi cruzi Iseladas norecôncavoBaiano。 Revista de Patologia热带。 卷。 3，p。 65-121。 1974。 Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。 Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。 卷。 30，p。 27-35。 1997。 Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，S。G。Caracterizaçãodecepas de trypanosoma cruzi cruzi Iseladas norecôncavoBaiano。Revista de Patologia热带。卷。3，p。 65-121。1974。Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。 Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。 卷。 30，p。 27-35。 1997。 Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，S.G。; Magalhães，J.B。锥虫菌株的生物植物和扎伊米亚：与临床数据和实验病理学的相关性。Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical。卷。30，p。 27-35。1997。Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。 同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。 皇家热带医学和卫生学会的交易。 卷。 76，p。 796-799。 1983。 Avila，I。I.等。 通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。 分子和生化寄生虫学。 卷。 42，p.175 - 188。 1990。 Britto，C。等。 一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。 memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。 。 v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。Andrade，V。; Brodskyn，c。 Andrade，S.G。同工酶模式与克鲁氏锥虫菌株的生物bahaviour之间的相关性。皇家热带医学和卫生学会的交易。卷。76，p。 796-799。1983。Avila，I。I.等。通过分析PCR的分析 - 放大微圆的可变区域序列，对来自南部和中部América的Cruzi菌群的精神分裂质分析。分子和生化寄生虫学。卷。42，p.175 - 188。1990。Britto，C。等。一种简单的方案，用于血液样本中存在于血样中的锥虫动力学DNA的物理裂解，以及在聚合酶链反应（PCR）中使用的ITSM-基于慢性Chagas疾病的诊断。memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。。v。88，p。 171-172.1993。 Britto，C等。 聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。 寄生虫学。 卷。 110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。v。88，p。 171-172.1993。Britto，C等。聚合酶链链反应检测人类血液样本中锥虫的锥虫瘤作为诊断和治疗评估的工具。寄生虫学。卷。110，p。 241-247.1995。 ______。 等。 卷。 卷。110，p。 241-247.1995。______。等。卷。卷。聚合酶链反应检测：对慢性chagas病的诊断的新见解。memóriasdo Instituto Oswaldo Cruz。94，p。 305-306.1999。______。等。o。被Xenodiongensis和聚合酶链反应MemóriosDo Instituto Oswaldo Cruz揭示的经过治疗的chagasic患者的寄生虫持久性。v。96，2001。p。 1-4。 Clark，C。G.核糖增生：原生动物分类法的分子方法。 in：Lee，J.J。 ＆Soldo，A.T。 （ed。 ）：原子学方面的协议。 Allen Press。 1992。 Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。v。96，2001。p。 1-4。Clark，C。G.核糖增生：原生动物分类法的分子方法。in：Lee，J.J。 ＆Soldo，A.T。（ed。）：原子学方面的协议。Allen Press。 1992。 Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Allen Press。1992。Clark，C.G。 ; Martin，D.S。 ; Diamond，L.S。 ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。 真核微生物学杂志。 42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Clark，C.G。; Martin，D.S。; Diamond，L.S。ruboprinting揭示的Anuran锥虫之间的系统发育关系。真核微生物学杂志。42，p。 92-96。 1999。 Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。42，p。 92-96。1999。Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。 in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。 ）：人类寄生虫； ed。 雅典。 2002。Lana，M。; Tafuri，W。L.锥虫Cruzi adoençade Chagas。in：Neves，D。P。; Melo，A。L。； Genaro，A。＆Linardi，P。M（编辑。）：人类寄生虫； ed。雅典。2002。
使用 AlphaFold 对寄生虫克氏锥虫进行药物靶点的计算机模拟探索
恰加斯病是一种由克氏锥虫引起的、被忽视的毁灭性疾病，影响着全球数百万人。现有的两种抗寄生虫药物硝呋莫司和苯并硝唑对感染的急性期有良好的疗效。但急性期疗效较差，通常无症状，因此经常无法诊断。治疗大多发生在慢性期，即出现危及心脏和/或消化系统的致命症状时。此后，这两种药物的疗效都会降低，而且长期服药常常会产生不良反应，影响治疗依从性。因此，迫切需要发现更安全、更有效的药物。尽管与最近使用的表型筛选相比，基于靶标的新型抗寄生虫分子的鉴定具有优势，但由于注释不完整以及缺乏寄生虫蛋白质空间结构，因此受到阻碍。目前，AlphaFold 蛋白质结构数据库拥有 19,036 个来自克氏锥虫的蛋白质模型，这些模型不仅可以成为描述新治疗方法的关键，还可以阐明已知化合物的分子作用机制。在这项概念验证研究中，我们筛选了 AlphaFold 克氏锥虫预测蛋白质模型集，以使用基于对接的逆向虚拟筛选为预先选择的已知抗锥虫活性的化合物列表寻找潜在靶标。详细分析了最有希望的配体的最佳受体（靶标），以解决分子相互作用和潜在药物的作用方式。结果深入了解了化合物及其靶标的作用机制，并为寻找新化合物或优化现有化合物的新策略铺平了道路。
牛皮物种的反寄生虫活性以及山苯胺和苯尼唑之间针对锥虫的锥虫
1生物学家研究所，圣约翰国立大学工程师学院。2，，组织学家和外皮学家研究所“博士Mario H. Burgos”，Concower国立大学，Mendoza CP 5500，农场学院的食品食品，巴塞罗那大学，西班牙巴塞罗那08028 *通信：这些作者做出了贡献。
使用说明-IBMP Kit Biomol Agro T. Cruzi -Page 1
12。质量控制程序CP护理的建议：应谨慎和注意处理阳性控制，以避免样品井中可能的CP污染，这可能会导致假阳性结果； - 谨慎避免交叉污染：应在核酸操纵室内处理该套件，并进行正式污染。应使用正确的技术来避免样品之间的污染。CI由一个保守的植物基因组成，该基因发生在多个基因组拷贝中。因此，在没有适当净化的情况下对其他机舱中其他植物样品的操纵可能会导致该靶标的非特异性扩增，这可能会导致假阴性结果； - 处置：因为它是对潜在的致病生物样品的操纵，因此使用后，应将套件组件视为污染物，因此应根据当前的立法和地方机构规范丢弃。
使用高效无克隆 CRISPR/Cas9 系统对克氏锥虫中假定的 cAMP 和 Ca2+ 调节蛋白进行基因编辑
摘要 克氏锥虫是恰加斯病的病原体，在其生命周期中必须适应各种环境条件。对这些变化的适应由信号通路介导，这些信号通路协调细胞对新环境的反应。环磷酸腺苷 (cAMP) 和钙 (Ca 2+ ) 信号通路调节此寄生虫中的关键细胞过程，例如分化、渗透调节、宿主细胞侵袭和细胞生物能量学。尽管 CRISPR/Cas9 技术的使用促使人们利用反向遗传学方法对克氏锥虫进行功能分析，但仍有必要扩展此寄生虫的基因组编辑工具箱，例如进行多基因分析。在这里，我们使用了一种有效的 T7RNAP/Cas9 策略来标记和删除三个预测参与 cAMP 和 Ca 2+ 信号通路的基因：假定的 Ca 2+ /钙调蛋白依赖性蛋白激酶 ( CAMK )、鞭毛成员 6 ( FLAM6 ) 和环核苷酸结合域/C2 结构域含蛋白 ( CC2CP )。我们内源性地标记了这三个基因并确定了标记蛋白的亚细胞定位。此外，用于敲除这些基因的策略使我们推测 TcCC2CP 是克氏锥虫上鞭毛体中的必需基因。我们的研究结果将为未来研究这些蛋白质在克氏锥虫中的作用开辟新的途径。
使用有效的无克隆CRISPR/CAS9系统在锥虫质质量
*通信。M.A.Chiurillo，辛辛那提大学生物科学系，辛辛那提，俄亥俄州45221-006，美国。电话号码：（+1）513-556-9758传真号码：（+1）513-556-5299电子邮件：chiurima@ucmail.uc.uc.uc.uc.uc.uc.edu N. Lander，辛辛那提大学，辛辛那提大学的生物科学系，辛辛那提大学，俄亥俄州俄亥俄州4522221-11-纽约州。电话号码：（+1）513-556-9798传真号码：（+1）513-556-5299电子邮件：landernm@ucmail.uc.uc.uc.edu