。cc-by-nd 4.0国际许可证(未经同行评审证明)获得的是作者/资助者,他已授予Biorxiv的许可证,以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人,该版本发布于2024年11月8日。 https://doi.org/10.1101/2024.08.06.606879 doi:Biorxiv Preprint
此预印本版的版权持有人于2024年6月14日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.06.12.598760 doi:Biorxiv Preprint
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Neoformans是真菌性脑膜炎的最常见原因,是一种基础性菌群单倍体发芽的酵母,具有完整的性周期。通过生物学转化和长长的同源臂,通过同源重组进行基因组修饰是可行的,但是该方法是艰巨而不可靠的。最近,多个小组报道了使用CRISPR-CAS9作为生物学的替代方案,但仍然有必要使用长期的HOMOLOG ARM,从而限制了该方法的实用性。由于在先前研究中使用的链球菌CAS9衍生物在Neoformans中没有选择用于表达,因此我们设计,合成并测试了全梭状芽胞杆菌(C. neoformans)的全念珠菌(CNO)Cas9。我们发现,CAS9仅带有常见的Neoformans密码子和共有的C. Neoformans内含子以及TEF1启动子和终结器以及核定位信号(CNO Cas9或“ CNOCAS9”)可靠地可靠地在C. Neoformans菌株中可靠地编辑基因组。此外,使用带有短(50bp)同源臂的供体来完成编辑,这些捐赠者附着于标记DNA上,这些供体与合成的寡核苷酸和PCR扩增一起产生。我们还证明,先前的CNOCAS9稳定整合进一步增强了转移和同源重组效率。重要的是,这种操作不会影响动物的毒力。我们还建立了一个通用标记的模块,该模块具有密码子优化的荧光蛋白(Mneongreen)和一个串联的钙调蛋白结合肽-2X标志标签,允许对蛋白质进行本地化和纯化研究,以对相应的基因进行简短授权的重新构造对相应的基因进行修改。这些工具使Neoformans中的短体系基因组工程能够。
