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等位基因多样性的探索揭示了一种新的 FAD2（油酸...
摘要：印度芥菜（Brassica juncea）是印度食用油供应的重要来源。传统的印度芥菜品种在种子中含有高比例的 18C 多不饱和脂肪酸（亚油酸和亚麻酸）和大量的长链单不饱和脂肪酸，主要是芥酸。油酸去饱和酶 (FAD2) 调节细胞膜中 18C PUFA 和种子油中 TAG 的组成。本研究旨在深入了解印度芥菜中 FAD2 基因的等位基因多样性。对三个印度芥菜品种的克隆 FAD2 基因的分析发现了一个新的 FAD2 基因，由于插入和长度上的几个 SNP，该基因具有更长的 ORF（1167 bp），这与更普遍的天然 FAD2 基因有所区别。总体而言，印度芥菜品种拥有三种 FAD2 等位基因，但不同品种中每种 FAD2 类型的成员之间的核苷酸多样性有限，这表明所检查品种之间的遗传多样性较窄。
利用 CRISPR-Cas9 敲除 FAD2 基因提高六倍体亚麻荠籽油中单不饱和脂肪酸含量
种子油可用作食用油，也越来越多地用于工业用途。尽管高油酸种子油更适合工业用途，但大多数种子油富含多不饱和脂肪酸 (PUFA)，而油酸等单不饱和脂肪酸 (MUFA) 含量较低。亚麻荠油是一种新兴的油籽作物，种子含油量高，且能抵抗环境压力，其含有 60% 的 PUFA 和 30% 的 MUFA。六倍体亚麻荠携带三种 FAD2 同源物，编码脂肪酸去饱和酶 2 (FAD2)，负责从油酸合成亚油酸。在本研究中，为了增加亚麻荠籽油中的 MUFA 含量，我们通过 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑生成了 CsFAD2 敲除植物，使用包含 DsRed 作为选择标记的 pRedU6fad2EcCas9 载体、用于驱动覆盖三个 CsFAD2 同源物共同区域的单个向导 RNA (sgRNA) 的 U6 启动子以及用于驱动 Cas9 表达的卵细胞特异性启动子。我们使用来自转化亚麻荠叶片的基因组 DNA 通过 PCR 分析了 CsFAD2 同源物特异性序列。三对 FAD2 同源物的敲除导致矮小的丛生表型，但大大提高了种子中的 MUFA 水平（提高了 80%）。然而，具有两对 CsFAD2 同源物的转化子被敲除，但另一对野生型杂合子显示正常生长，种子 MUFA 产量增加了 60%。这些结果为通过基因组编辑影响多倍体作物生长的基因代谢工程提供了基础。
24-116-02rsr.pdf - 动物和植物卫生检验局
内质网相关油酸去饱和酶 FAD2 是植物非光合作用组织中产生亚油酸的关键酶。在大豆中，已报道两种不同的 FAD2 同工酶：一种组成性表达基因，称为 FAD2-2 ，另一种种子特异性基因，称为 FAD2-1 。FAD2-1 的两种种子特异性同工酶，称为 FAD2-1A 和 FAD2-1B ，仅在 24 个氨基酸残基处不同（Tang 等人，2005 年），在确定种子储存油的脂肪酸组成方面起着关键作用（Heppard 等人，1996 年；Kinney，1997 年）。与 GmFAD2-1 成员不同，GmFAD2-2 成员表现出细胞质定位，这可能表明大豆中存在一种替代的脂肪酸去饱和酶途径，用于转化油酸含量，而不会显著改变传统的质体/内质网脂肪酸生产（Lakhssassi 等人，2021 年）。
通过 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑改善水芹 (Lepidium campestre) 的脂肪酸组成
野生种田芥（Lepidium campestre）有潜力成为适合北欧气候的新型覆盖作物和油籽作物。然而，由于多不饱和脂肪酸 (PUFA) 和芥酸 (C22:1) 含量高，其种子油目前不适合大多数食品、饲料和工业应用。由于这些不良脂肪酸的生物合成受一些众所周知的主要显性基因控制，因此使用 CRISPR/Cas9 敲除这些基因将更有效地提高种子油的质量。为了提高所需油酸 (C18:1) 的含量，并降低 PUFA 和 C22:1 的含量，我们利用基于原生质体的 CRISPR/Cas9 基因敲除系统，针对三个重要基因脂肪酸延长酶 1 ( FAE1 )、脂肪酸去饱和酶 2 ( FAD2 ) 和还原油酸去饱和酶 1 (ROD1 )。通过敲除 FAE1 ，我们获得了一个几乎没有 C22:1 的突变株系，但 C18:1 增加到 30%，而野生型为 13%。敲除 ROD1 导致 C18:1 增加到 23%，PUFA 含量中等但显著降低。 FAD2 的敲除与杂合 FAE1fae1 基因型相结合，产生了突变株系，其 C18:1 含量高达 66%，PUFA 含量极低，C22:1 显著降低。我们的研究结果清楚地表明，CRISPR/Cas9 具有快速改良水芹性状的潜力，这将加快其驯化过程。本研究产生的突变株系可用于进一步育种，以将水芹培育成可行的作物。
开发具有优良保健功能的高油酸油菜籽
图 1 植物中脂肪酸和三酰甘油合成途径的示意图。虚线显示三酰甘油合成中脂肪酸的流动。ACC，乙酰辅酶 A 羧化酶；ACP，酰基载体蛋白；CoA，辅酶 A；DGAT，二酰甘油酰基转移酶；FAB2，脂肪酸生物合成 2；FAD2，脂肪酸去饱和酶 2；FAD3，脂肪酸去饱和酶 3；FAE1，脂肪酸延长酶 1；FATA，脂肪酰基-ACP 硫酯酶 A；FATB，脂肪酰基-ACP 硫酯酶 B；KAS，β-酮酰基-酰基载体蛋白合酶；LMAT，丙二酰辅酶 A/ACP；PC，磷脂酰胆碱； PDCT，磷脂酰胆碱：二酰甘油胆碱磷酸转移酶。
7.10.24 致美国农业部关于 Qi Biodesign 的信.pdf
1 美国农业部。2024 年 5 月 29 日。“利用基因工程开发大豆的监管状况审查，以消除种子特异性 FAD2 等位基因的功能丧失。”https://www.aphis.usda.gov/sites/default/files/24-116-02rsr-response.pdf 2 美国贸易代表。2020 年 1 月 15 日。“美利坚合众国和中华人民共和国之间的经济贸易协定，情况说明书。”https://ustr.gov/sites/default/files/files/agreements/phase%20one%20agreement/Phase_One_Agreement-Commodity_Fact_Sheet-Ag_Biotech.pdf 3 Qi Biodesign。2023 年 9 月 15 日。“两年团结，满怀信心地向前迈进——写于 Qi Biodesign 成立两周年之际。”https://shorturl.at/fSAKD
利用 CRISPR/nCas9 对花生进行碱基编辑
花生 ( Arachis hypogaea L.) 是豆科植物的异源四倍体，能够在热带和亚热带地区生长茂盛，被认为是一种很有前途的全球油籽作物。提高油酸含量已成为花生育种的主要目标之一，因为它具有降低血液胆固醇水平等健康益处、抗氧化特性以及延长保质期等工业效益。花生基因组测序已证明存在编码脂肪酸去饱和酶 2 ( FAD2 ) 的同源基因 AhFAD2A 和 AhFAD2B，它们负责催化单不饱和油酸转化为多不饱和亚油酸。研究表明，导致 FAD2 基因移码或终止密码子的突变会导致油中油酸含量升高。在本研究中，使用与不同脱氨酶融合的 Cas9 构建了两个表达载体 pDW3873 和 pDW3876，并测试了它们作为诱导花生 AhFAD2 基因启动子和编码序列点突变的工具。两种构建体都含有单核酸酶无效变体 nCas9 D10A，PmCDA1 胞嘧啶脱氨酶与该变体融合到 C 端（pDW3873），而 rAPOBEC1 脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 分别融合到 N 端和 C 端（pDW3876）。将三个 gRNA 独立克隆到两个构建体中，并在 AhFAD2 基因的三个靶位点测试其功能和效率。两种构建体都显示出碱基编辑活性，其中在靶向编辑窗口中胞嘧啶被胸腺嘧啶或其他碱基取代。 pDW3873 的效率高于 pDW3876，表明前者是花生中更好的碱基编辑器。这是一个重要的进步，因为将现有突变基因渗入优良品种可能需要长达 15 年的时间，这使得该工具对花生育种者、农民、行业以及最终对消费者都大有裨益。
CRISPR/Cas9 介导的 BnFAD2 和 BnFAE1 基因编辑改变了油菜中的脂肪酸谱
摘要：脂肪酸组成决定了油料作物油脂的品质，是遗传改良的重要目标。FAD2（脂肪酸脱氢酶2）和FAE1（脂肪酸延长酶1）是关键的脂肪酸合成基因，已成为遗传操作改变油料植物脂肪酸组成的重点研究对象。本研究以油菜品种CY2（含油量约50%；其中芥酸含量为40%）为营养品质，利用CRISPR/Cas9介导的BnFAD2和BnFAE1基因基因组编辑技术，获得新型敲除植物。设计两条引导RNA，分别针对一个拷贝的BnFAD2基因和两个拷贝的BnFAE1基因。通过序列分析，鉴定出一些在BnFAD2和BnFAE1基因的3个靶位点发生突变的株系。其中三个品系在 BnFAD2 和 BnFAE1 基因的所有三个靶位点均发生了突变。种子脂肪酸组成分析表明，所有三个位点的突变导致油酸含量（70–80%）与 CY2（20%）相比显著增加，芥酸含量大大降低，多不饱和脂肪酸含量略有下降。我们的结果证实了 CRISPR/Cas9 系统是改良这一重要性状的有效工具。
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，可以建立UPO
目标1：为大豆开发有效的无PAM无PAM CAS9和主要的编辑平台。这是一个基因编辑工具开发目标，它基于我们先前开发的CRISPR-CAS9基因编辑平台。为大豆建造主要的编辑系统。基于SPCAS9 Nickase的两个不同变体和M-MLV的逆转录酶，已经为大豆毛的根和稳定的转化和基因组编辑制作了三个主要的编辑系统。分别使用命名为PE1，PE2和PE3的三个系统，以制造针对编码CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50的大豆基因的主要编辑构建体。PE1和PE2系统，以确定哪种最适合于创建精确的遗传变化，以改善大豆的性状。不幸的是，这两个系统无效地在毛状根中的四个CDPK基因中创建突变。因此，我们决定使用PE2系统测试其他基因FAD2和EPSP，并且再次没有发现靶基因已修改的证据。第三个Prime编辑版本，名为PE3，还测试了在毛状根部编辑FAD2和EPSP基因的能力，这也没有成功。PE1，PE2和PE3 PRIME编辑构建体在大豆中似乎不起作用，因此我们正在采用替代方法来修改向量，以使用不同的策略来生成Prime编辑指南RNA。这些结构将在下一个报告期间进行测试。总而言之，使用在其他工厂中使用的策略，在大豆中的主要编辑应用并不能有效。1。我们继续努力确定将在大豆中有效的主要编辑策略。目标2：应用基础编辑和主要编辑来修改影响大豆对干旱反应的基因。我们设计了两种不同的CRISPR-Cas9构建体来敲除CDPK基因的功能，这些功能被预测会影响大豆对干旱的反应。基于CRISPR-CAS9的基因敲除大豆CDPK家族基因（CDPK47、48、49和50）的两个CRISPR构建体（NK44和NK46）已建立，以敲除CDPK基因的两种组合。a。 NK44：PATEC-INCAS9-GCDPK49-50（靶向CDPK49和CDPK50）b。 NK46：PATEC-INCAS9-GCDPK47-50（靶向CDPK47，CDPK48，CDPK49和CDPK50）对这两种构建体进行了大豆转化，并为转染料的存在而基因型进行了基因型。我们为NK44构建体获得了四个转基因阳性植物。我们总共获得了NK46构建体的七个转基因阳性植物。种子，我们将这些种子称为T1代。至少为每条线发芽了至少24个T1幼苗，我们进行了PCR首先确定NK44或NK46构建体是遗传的，我们
研究论文 开放获取 CRISPR/Cas9 介导的靶向
向日葵 ( Helianthus annuus L.) 是世界上最重要的油料作物之一，用途广泛 (Hu 等，2010)。根据脂肪酸组成，向日葵可分为高油酸 (85%)、中油酸 (60-65%) 和亚油酸 (低油酸)。世界对高油酸向日葵的生产和消费需求不断增加，因为高油酸向日葵基因型在工业用途和人类健康方面具有各种优势 (Kaya 等，2007)。向日葵的油组成可以通过对脂肪酸去饱和酶 2 ( FAD2 ) 基因进行遗传修饰来改变，这种修饰促进油酸到亚油酸的生物转化。使用化学诱变剂二甲基亚砜 (DMSO) 可将 Pervenets 向日葵品种的油酸组成提高至 75%（Soldatov 等人，1976 年）。许多衍生自突变体 Pervenets 的自交系的油酸组成高达 90%（Fernandez-Martinez 等人，1993 年；Miller 等人，1987 年；Zambelli 等人，2015 年）。此外，Vick & Miller（1996 年）报道了通过使用乙基甲烷磺酸盐 (EMS) 处理来开发高油酸和中油酸向日葵突变体。同样，Leon 等人（2013b）也进行了 EMS 处理以开发高油酸突变体。该处理诱导了点突变，导致氨基酸替换和过早终止密码子（Leon 等人，2013b）。另一方面，FAD2-1基因的重复导致基因转录沉默，从而导致油酸的积累（Lacombe等，2009；Martinez-Rivas等，2001）。此外，Schuppert等（2006）也报道了高油酸突变体向日葵是通过FAD2-1基因的重复和向日葵基因型中油酰磷脂酰胆碱去饱和酶的诱导而产生的。