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CTS 氙气电穿孔系统
Gibco™ CTS™ Xenon™ 电穿孔仪器 Cat. No. A50301 建议细胞浓度 20 x 10⁶ 至 100 x 10⁶ 细胞/mL 电穿孔体积 1 mL； 5–25 mL 电穿孔室容量 1 mL 5–25 mL 电穿孔体积的运行时间 7–22 分钟 电穿孔脉冲电压范围 500–2,500 V 电穿孔脉冲宽度范围 1–30 ms 电穿孔脉冲间隔范围 500–1,000 ms 电穿孔脉冲数 1–10 支持 21 CFR 第 11 部分合规性 是，可进行软件升级（请咨询） 开放平台通信 - 统一架构 (OPC-UA) 兼容性 是 云连接实用程序 是 细胞搅拌器转速 60 rpm 预冷技术 Peltier 预冷温度设定范围 10–30°C 尺寸（高 x 宽 x 深），门完全打开时 43.1 x 26.5 x 21.2 英寸（109.5 x 67.4 x 53.9 厘米） 重量 154.3 磅（70 千克） 电气额定值 100–240 V， 1,200 VA 触摸显示屏 8 英寸电容式
1766。毛毛虫的培养培养基
500 mL Eagle的MEM（Sigma M4655）5 ml MEM非必需氨基酸（Gibco 11140-050）5 ml L-L-l-谷氨酰胺（Sigma G7513）5 ml p钠钠（Sigma s8636）（Sigma S8636）50 mL fetal bovine sote storme forter inter inter inter inter instermize insterim insterize instermize fellimize fortile comle c.不必将预筛选的苍白链球菌允许FBS用于SF1EP细胞的常规培养。细胞培养程序SF1EP细胞直接从ATCC®获得，源自原代细胞，其有限寿命约为27-30段。因此，重要的是要制作大型SF1EP细胞的冷冻种子库存。这些细胞具有上皮形的形态，当它们到达汇合时，它们的外观呈多边形或鹅卵石外观。这些低通道SF1EP生长缓慢，并在每二周进行1：5。我们具有SF1EP细胞的不朽细胞系，该细胞是从ATCC®细胞自发产生的。这些细胞的生长速度比原始细胞生长要快得多，生长到更高的密度，并在达到高密度时采用纺锤形的细胞形态。最初，这些支持T. pallidum的生长以及原始的SF1EP细胞，并且更容易大量生产。然而，在达到65的通道后，甲虫的生长会减少，应丢弃，并应融化细胞的较低传递培养。我们可以向希望启动体外培养的任何人提供此细胞系。这些是每周1:15的亚文化。使用无菌技术在生物安全柜中执行所有操纵。
机器的补充信息...
材料。Fmoc-β-amino acids, including Fmoc- L -β-homoalanine, Fmoc- L -β-homoisoleucine, Fmoc- L -β-homoleucine, Fmoc- L -β-homophenylalanine, Fmoc-(1S,2S)-2-aminocyclopentane carboxylic acid, Nβ-Fmoc-Nω-Boc- L -β-homolysine, Fmoc-O-tert-butyl- L -β-homoserine, and Fmoc-α-amino acids, including Fmoc-glycine, Fmoc- L -alanine, Fmoc- L -isoleucine, Fmoc- L - leucine, Fmoc- L -phenylalanine, Fmoc-O-tert-butyl- L -serine, FMOC-L-β-双晶，FMOC-L-主要酸β-TERT-丁基酯，FMOC-L-谷氨酸γ-tert-叔丁基酯，Nα-FMOC-Nε-boc-l-赖氨酸是从Chem-impex International，Inc.（Wood Dale，Inc.，IL，USA，USA，USA）购买的。fmoc-l-脱毛氨酸是从热科学化学品购买的。FMOC-L-Norvaline购自Santa Cruz Biotechnology。hatu是从奥克伍德化学品获得的。Tentagel S RAM FMOC购自Advanced Chemtech（肯塔基州路易斯维尔）。Menadione，N，N-二异丙甲胺，Mueller Hinton肉汤和磷酸二氮的磷酸钠，是从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得的。3-（n-甲磷脂）丙烷磺酸（MOPS）获自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-羧基（XTT）购自从Invitrogen购买。Gibco Brand RPMI 1640粉末（含有苯酚红和L-谷氨酰胺，没有碳酸氢钠或HEPES）和Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPB，无钙或镁）是从Thermo Fisher Scientific（MA）获得的。使用Millipore过滤系统纯化水（18.2MΩ）。细胞滴度GLO 2.0分析套件来自Promega（WI）。
鉴定人类细胞中复制应力反应的关键因素Louise M.E. Janssen 1，Empar Baltasar Perez 1，Chantal Vaartin
方法在补充了10％FCS，1％谷歌补充剂（Gibco），100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素的IMDM（Gibco）中培养了衍生成近单倍型HAP1细胞的细胞培养。siRNA转染是根据制造商的指南使用Rnaimax（Invitrogen）进行的。在这项研究中使用了以下siRNA：Sinon-targetable（Dharmacon），Sipolg2（地平线，TargetPlus，SmartPool），SIMRPL23（Horizon，Targetplus，TargetPlus，Smartpool）。将所有药物（Aphidicolin，Hu，Olaparib，Rad51i（B02），DNA-PKI（NU74441）和寡霉素A）溶解在DMSO中，并以指示浓度使用。细胞使用具有137CS源的γ提取器（最佳疗法）进行γ辐射。生长测定HAP1细胞以1500个细胞/孔的密度将HAP1细胞铺在96孔板中，并被视为5天。5天后，使用100％甲醇固定细胞，并在室温下使用Crystal Violet染色2H。随后，将晶体紫溶解在10％乙酸中，并使用Biotek Epoch Epoch分光光度计在595 nm处测量强度。使用非线性拟合，sigmoidal，4pl，x是log（浓度），将这些测量值用于棱镜中的IC50计算。在9mm玻璃盖上生长免疫荧光细胞，并在室温下以4％甲醛和0.2％Triton X-100固定10分钟。使用了以下抗体：人类抗克雷斯特（Cortex Biochem，CS1058），兔抗PH3SER10（Campro，＃07-081），小鼠抗ERCC6L（PICH）（ABNOVA，ABNOVA，000548421-B01P）。所有初级抗体在4°C的夜间孵育。使用固定缓冲液I（BD生物科学）固定细胞。细胞。二级抗体（分子探针，Invitrogen）和DAPI在室温下孵育2小时。使用延长金（Invitrogen）安装盖玻片。使用具有60倍1.40 Na油目标的Deltavision Deonvolution显微镜（Applied Precision）获取图像。SoftWorx（应用精度），ImageJ，Adobe Photoshop和Illustrator CS6用于处理获得的图像。单倍体插入诱变筛选基因对用APH或HU处理的HAP1细胞的存活至关重要，如先前所述35，使用单倍体插入诱变筛查鉴定。诱变的HAP1细胞是从Brummelkamp实验室获得的。简短地，获得HAP1细胞的诱变如下：在HEK293T细胞中产生了基因陷阱逆转录病毒。每天两次收获逆转录病毒至少三天，并通过离心（使用SW28转子进行2小时，21,000 rpm，4°C，4°C）进行沉淀。在8μg/ml硫酸素硫酸素的存在下，在T175烧瓶中至少连续两天，在8μg/ml硫酸素的存在下，将大约4000万个HAP1细胞通过浓缩基因陷阱病毒的转导而被诱变。在包含10％DMSO和10％FCS的IMDM培养基中冷冻诱变细胞。解冻后，在存在27.5 nm adphidicolin或100μmHu的情况下，将诱变的HAP1细胞转移了10天。传递后，通过胰蛋白酶-EDTA收集细胞，然后进行沉淀。为了最大程度地减少潜在地含有杂合突变的二倍体细胞的混杂，用DAPI染色固定的细胞，以允许使用Astrios Moflo对G1单倍体DNA含量进行分类。将3000万个排序的细胞在56°C下裂解过夜，以使使用DNA迷你试剂盒（QIAGEN）进行基因组DNA分离。插入位点映射基因陷阱插入位点通过LAM-PCR放大，然后进行捕获，ssDNA接头连接和指数放大，并在测序之前使用含有Illumina适配器的引物，如前所述，如前所述35。映射和插入位点的分析以前描述了78。简短地，在对HISEQ 2000或HISEQ 2500（Illumina）进行测序之后，将插入位点映射到人类基因组（H19），允许一个不匹配，并与RefSeq坐标相交，以将插入位点分配给基因。基因区域在相对链上重叠的基因区域没有考虑进行分析，而对于在相同链基因名称上重叠的基因是串联的。对于每种复制和两种药物治疗（APH或HU）基因的必要性都是通过二项式检验确定的。合成致死性。一个基因通过所有Fisher的测试，其p值截止为0.05，效应大小至少为0.12（减法比率wt sense比率 - 复制应力条件感官比率）。