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利用 All-in-One 和 HITI CRISPR 技术在中国仓鼠卵巢细胞系中进行多重基因组编辑
简介 在哺乳动物细胞系中产生有利的基因组特征是基因功能研究极为宝贵的策略之一。1,2 基因组编辑主要通过使用传统方法进行，例如 RNA 干扰 3,4 和同源重组。然而，除了染色体 DNA 的自发裂解之外，所需突变体的频率低和特异性低导致了位点特异性核酸酶的发明。最近，成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关 (Cas) 系统为在特定基因组位点快速有效地进行基因编辑打开了一扇有希望的窗口。5,6 CRISPR/Cas9 系统由两个组件组成：向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白的核酸酶活性可在任何被 gRNA 识别的基因组区域中诱导 DNA 双链断裂 (DSB)。该 gRNA 必须伴随目标基因座中相邻的原间隔基序 (PAM) 序列。7,8 NGG 是化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的 PAM 序列，是最
通过同源性独立的靶向整合进行体内基因编辑以治疗肾上腺脑白质营养不良
肾上腺脑白质营养不良 (ALD) 是由 X 连锁 ABCD1 基因的各种致病突变引起的，这种突变会导致许多器官中极长链脂肪酸的代谢异常积累。然而，ALD 尚未实现治愈性治疗。为了治疗 ALD，我们在 ALD 患者来源的成纤维细胞中应用了两种不同的基因编辑策略，即碱基编辑和同源性独立的靶向整合 (HITI)。接下来，我们使用通过静脉注射递送的 AAV9 载体在 ALD 模型小鼠中进行了体内 HITI 介导的基因编辑。我们发现 HITI 治疗的小鼠的 ABCD1 mRNA 水平显著升高，而 ALD 的敏感诊断标志物 C24:0-LysoPC（溶血磷脂酰胆碱）和 C26:0-LysoPC 的血浆水平显著降低。这些结果表明，HITI 介导的突变基因拯救可能是人类 ALD 治疗的一种有前途的治疗策略。
使用 RNAi 在中国仓鼠卵巢细胞中同时敲入/敲除 Caspase 8 相关蛋白 2 基因的时间和成本有效的基因组编辑方案
背景：CHO 细胞是生产生物制药的首选，而基因组编辑技术为提高重组蛋白产量提供了机会。靶向凋亡相关基因，如 Caspases 8 相关蛋白 2 (CASP8AP2)，可提高 CHO 细胞的活力和生产力。将强大的策略与 CRISPR-Cas9 系统相结合使其能够应用于 CHO 细胞工程。目标：本研究旨在开发一种经济有效的方案，使用 CRISPR-Cas9 系统结合 HITI 策略同时在 CHO 细胞中缺失/插入 CASP8AP2 基因，并评估其对细胞活力和蛋白质表达的影响。材料和方法：我们通过将 CRISPR/Cas9 与 HITI 策略相结合，开发了一种有效的 CHO 细胞工程方案。使用 CHOPCHOP 软件设计了两个不同的 sgRNA 序列以靶向 CASP8AP2 基因的 3' UTR 区域。使用经济高效的 PEI 试剂将 gRNA 克隆到 PX459 和 PX460-1 载体中，并转染到 CHO 细胞中。采用手动选择系统简化单细胞克隆过程。MTT 测定评估 24、48 和 72 小时的基因沉默和细胞活力。流式细胞术评估 CASP8AP2 沉默的 CHO 细胞中的蛋白质表达。结果：研究证实了将 CRISPR-Cas9 与 HITI 策略相结合的稳健性，在产生敲除克隆方面实现了 60% 的高效率。PEI 转染成功地将构建体传递给近 65% 的克隆，其中大多数是纯合的。该方案被证明适用于资源有限的实验室，只需要倒置荧光显微镜。 CASP8AP2 敲除 (CHO-KO) 细胞经 NaBu 处理后，与 CHO-K1 细胞相比，其细胞存活率显著延长，48 小时时的 IC50 值分别为 7.28 mM 和 14.25 mM（P 值：24 小时 ≤ 0.0001，48 小时 ≤ 0.0001，P 值：72 小时 = 0.0007）。与天然细胞相比，CHO CASP8AP2 沉默细胞的 JRed 表达增加了 1.3 倍。结论：使用 CRISPR-Cas9 和 HITI 策略有效改造 CHO 细胞，同时进行 CASP8AP2 基因缺失/插入，从而提高细胞存活率和蛋白质表达。
降临节和安息日倡导者
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Plasmid2MC：高效无细胞重组质粒成高纯度微环 DNA 用于基因组编辑应用
DNA 质粒通常用于在基因组编辑中传递蛋白质和 RNA。然而，与缺乏此类细菌序列的微环 DNA (mcDNA) 相比，它们的细菌成分可能导致失活、细胞毒性和效率降低。现有的将质粒重组到专有细菌菌株内的 mcDNA 中的商业试剂盒劳动密集型，产生的结果不一致，并且通常产生低质量的 mcDNA。为了解决这个问题，我们开发了 Plasmid2MC，这是一种使用 Φ C31 重组的无细胞方法，可有效从常规制备的质粒中切除细菌骨架，而 mcDNA 纯化步骤可消化所有 DNA 杂质并降低内毒素水平。我们展示了 mcDNA 表达 CRISPR-dCas9 在 HEK293T 细胞和小鼠胚胎干细胞中的碱基编辑以及同源性独立的靶向插入 (HITI) 基因组编辑中的应用。该方法易于制备、效率高且 mcDNA 纯度高，使其成为需要细菌无骨架环状 DNA 的应用的宝贵替代方案。
糖尿病和高脂血症中的免疫训练
缩写：乙酰辅酶 A，乙酰辅酶 A；ASCVD，动脉粥样硬化性心血管疾病；ATM，脂肪组织巨噬细胞；BCG，卡介苗；CRP，高敏 C 反应蛋白；DAMP，损伤相关分子模式；FH，富马酸水合酶；H3K27ac，组蛋白 3 赖氨酸 27 乙酰化；H3K4me1，组蛋白 3 赖氨酸 4 单甲基化；H3K4me3，组蛋白 3 赖氨酸 4 三甲基化；HIF1 α，缺氧诱导因子 1 α；HITI，高血糖诱导的训练免疫；IL-1 β，白细胞介素 1 β；IL-6，白细胞介素 6；Ldlr，低密度脂蛋白受体； Lp(a)，脂蛋白(a)；LPS，脂多糖；LXRs，肝脏X受体；mTOR，雷帕霉素的机制靶点；NK，自然杀伤细胞；oxLDL，氧化LDL；OxPLs，氧化磷脂；PAMPs，病原体相关分子模式；PBMCs，外周血单核细胞；PRRs，模式识别受体；SAT，皮下脂肪组织；TCA，三羧酸循环；TIH，短暂性间歇性高血糖症；TLR，Toll样受体；TNF-α，肿瘤坏死因子α；VAT，内脏脂肪组织；WD，西方饮食。
使用CRISPR介导的集成系统将转基因的靶向敲入转基因进入CHO细胞基因组
抽象的生物药物蛋白通常是通过培养重组中国仓鼠卵巢（CHO）细胞而产生的。高生产者细胞系从转染的细胞中筛选，并随机整合靶基因。由于转基因表达易受综合基因组基因座的周围环境的影响，因此应从大量具有异质转基因插入的重组细胞中选择生产者细胞系。相比之下，靶向集成在特征的基因组基因座中可以预测的转基因表达和较少的克隆变异性，因此可以预期稳定的靶蛋白产生。基于基于可编程核酸酶的基因组编辑技术最近已成为细胞基因组中靶基因座精确编辑的多功能工具。在这里，我们使用CRISPR/CAS9和CRISPR介导的精确整合到靶染色体（PIST）系统中，证明了将转基因的靶向敲入转基因的CHO细胞中的低黄嘌呤磷酸糖基转移酶（HPRT）基因座。我们还基于与同源性的靶向集成（HITI）系统生成了敲入CHO细胞。我们使用这些系统评估了转基因在HPRT基因座中的敲门效率。
荧光体内编辑报告基因（FIVER）
摘要 基因组编辑技术的进步为治疗罕见遗传疾病创造了机会，而这些疾病在治疗开发方面往往被忽视。尽管如此，仍然存在重大挑战：即在正确的细胞类型中实现对治疗有益的编辑水平和种类。在这里，我们描述了 FIVER（荧光体内编辑报告基因）的开发——这是一种模块化工具包，用于体内检测基因组编辑，具有非同源末端连接（NHEJ）、同源定向修复（HDR）和同源独立的靶向整合（HITI）的不同荧光读数。我们证明荧光结果可靠地报告在原代细胞、类器官和体内使用不同基因组编辑器编辑后的遗传变化。我们展示了 FIVER 在高通量无偏筛选中的潜力，从原代细胞中基因组编辑结果的小分子调节剂到全基因组体内 CRISPR 癌症筛选。重要的是，我们展示了其在基因治疗感兴趣的出生后器官系统（视网膜和肝脏）中的体内应用。FIVER 将广泛地帮助加快许多遗传疾病的治疗性基因组手术的发展。
使用 AAV 介导的原位基因标记可视化哺乳动物大脑中的 Arc 蛋白动力学和定位
活性调节的细胞骨架相关 (Arc) 蛋白对于突触可塑性和记忆形成至关重要。Arc 基因含有结构 GAG 逆转录转座子序列的残余，它产生的蛋白质可自组装成含有 Arc mRNA 的衣壳状结构。从神经元释放的 Arc 衣壳已被提议作为一种新的 mRNA 传递细胞间机制。尽管如此，仍然缺乏 Arc 在哺乳动物大脑中细胞间运输的证据。为了能够在体内追踪来自单个神经元的 Arc 分子，我们设计了一种腺相关病毒 (AAV) 介导的方法，使用 CRISPR/Cas9 同源独立靶向整合 (HITI) 将荧光报告基因标记到小鼠 Arc 蛋白的 N 端。我们表明，编码 mCherry 的序列可以成功敲入 Arc 开放阅读框的 5′ 端。虽然 Arc 起始密码子周围有 9 个 spCas9 基因编辑位点，但编辑的准确性高度依赖于序列，只有一个靶标导致框内报告基因整合。在海马中诱导长期增强 (LTP) 时，我们观察到 Arc 蛋白的增加与荧光强度和 mCherry 阳性细胞数量的增加高度相关。通过邻近连接分析 (PLA)，我们证明 mCherry-Arc 融合蛋白通过与突触后棘中的跨膜蛋白 stargazin 相互作用而保留了 Arc 功能。最后，我们在靠近编辑神经元的 mCherry 阳性棘的 mCherry 阴性周围神经元中记录了 mCherry-Arc 与突触前蛋白 Bassoon 的相互作用。这是第一项为哺乳动物大脑中 Arc 的神经元间体内转移提供支持的研究。