XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemHalotag
Halotag®技术：水溶性配体
图3。使用JaneliaFluor®Halotag®配体的U2OS细胞的活细胞标记表达核Halotag®蛋白。父母U2OS细胞和U2OS细胞稳定地表达与三个核定位序列融合的halotag®蛋白被粘附在玻璃底室载玻片上，并用JaneliaFluor®503，JaneliaFluor®JFX554或Janelia fluor®JFX554或Janeliafluor®635collagang®ligand con Client + 30分钟在30分钟的clienteriafluor®503标记。孵化器。细胞培养基被苯酚红培养基取代。的细胞用488nm激光激发JaneliaFluor®503Halotag®配体（面板A），561nm激光激发JaneliaFluor®JFX554Halotag®Ligand（B）和637nm Laser raser contitation in Janeliafluor®JFX554Halotag®635®635Laseria®6355555。在表达halotag®细胞中，标记仅限于细胞核。父母细胞（无halotag）显示没有标记。使用尼康AX/AXR共聚焦显微镜收集图像，该显微镜具有计划荧光40倍油目标。
Halotag显示启用定量单
抽象的细胞外囊泡（EV）在不同的生物过程中起关键作用，细胞之间的生物分子运输，并且已为治疗应用设计。有用的EV生物工程策略是在EV表面表达工程蛋白，以赋予靶向，生物活性和其他特性。衡量掺入如何在电动汽车人群中变化对于表征这种材料和理解其功能很重要，但是定量表征单一EV分辨率掺入的工程蛋白的绝对数量仍然具有挑战性。为了满足这些需求，我们开发了一个基于挂钩的表征平台，在该平台中，染料或其他合成物种可以共价并在EV表面上连接到工程蛋白上。为了评估该系统，我们采用了几种正交定量方法，包括流式细胞体 - 尝试和荧光显微镜，发现Halotag介导的定量通常在EV分析方法中具有鲁棒性。我们使用单囊泡流式细胞仪比较了Halotag标记与EV的抗体标签，从而使我们能够确保抗体标记可以低估EV上存在的蛋白质的实质性程度。最后，我们证明了使用屏障来比较蛋白质设计的EV生物工程。总体而言，Halotag系统是一个有用的EV特征工具，可补充和扩展现有方法。
产品信息：晕圈（SC026）
Halo-Flipper是一种荧光探针，专门标记Halotag™*，并报告膜张力通过其荧光寿命变化而变化。它包含氯烷烃Halotag™*配体以及一个束缚的Flipper-TR荧光团，该荧光团感受着围绕Halotag™*蛋白质的脂质双层膜的组织变化。晕圈是可渗透的，自发标记表达细胞的挂钩，仅当插入脂质膜中时才荧光。它具有广泛的吸收和发射光谱，激发通常可以用488nm激光器进行，而发射则在575至625nm之间收集。这是精确定位细胞内曲面膜张力荧光团的理想工具。氯烷烃（CA）是自标签标签Halotag™*的底物。与CA衍生物反应后，Halotag™*与底物形成共价键。它允许将荧光标签永久连接到任何感兴趣的蛋白质（POI）（POI），以HALOTAG™*融合
系统分析关键 DNA 损伤反应因子的分子和生物物理特性
摘要 DNA 双链断裂 (DSB) 的修复对于保持基因组完整性至关重要。因此，定义 DSB 修复的潜在机制将增强我们对这些途径中的缺陷如何导致人类疾病的理解，并可能导致发现新的治疗干预方法。在这里，我们在 U2OS 细胞中建立了一组 HaloTagged DNA 损伤反应因子，这使得荧光 HaloTag 配体能够进行浓度依赖性蛋白质标记。在这些修复因子的内源位点处基因组插入 HaloTag 可保持表达水平，蛋白质保持适当的亚细胞定位、形成病灶的能力并在功能上支持 DSB 修复。我们系统地分析了总细胞蛋白质丰度，测量了激光诱导的 DNA 损伤位点的募集动力学，并通过活细胞单分子成像确定了扩散动力学和染色质结合特性。我们的工作表明，Shieldin 复合物（端接的关键因子）并不存在于预组装状态，并且这些因子在 DSB 处的相对积累具有不同的动力学。此外，活细胞单分子成像揭示了 MDC1 和染色质之间的组成性相互作用，该相互作用由其 PST 重复域介导。总之，我们的研究证明了单分子成像的实用性，可以为 DNA 修复提供机制见解，这将成为表征活细胞中 DNA 修复因子的生物物理特性的强大资源。
产品表CélulasT406 | 300361
通过促进荧光配体或其他探针的共价钩，Halotag允许实时成像，并为研究活细胞中的核转运机制提供了强大的工具。该特定的克隆（数字252）是为其稳定表达的NUP96的稳定表达而选择的，该表达可确保实验配置中的持续性能。此功能使其非常适合高分辨率成像技术和分子相互作用研究，从而支持细胞生物学的先进研究，特别是在核功能和遗传调节的背景下。
MDC连接：药物发现指南
纳米杆技术使用生物发光共振能量转移（BRET）研究活细胞中蛋白质蛋白质的相互作用。研究了成人骨形成的调节剂Schnurri-3的相互作用，与ERK-2使用了2个不同的载体。一个载体包含Schnurri-3和Nanoluc®，一种具有高效率生成光子的发光酶，第二个载体包含ERK-2 PlusHalotag®，荧光配体。当两种蛋白质接近近距离时，观察到荧光。确定了Schnurri-3-ERK相互作用抑制剂的纳米伯特分析以及纳米信号与荧光信号的比率。使用MEK在竞争相互作用的单元格中验证了这一点，如果过表达，则会降低荧光信号。
定量分析和优化哺乳动物细胞中位点特异性蛋白生物结合
摘要：尽管有多种共价蛋白质修饰，但很少有用于定量细胞中蛋白质生物结合的技术。在这里，我们描述了一种通过与Halotag共价键形成在纤维素蛋白生物偶联中量化的新方法。这种方法利用不自然的氨基酸（UAA）诱变选择性地在蛋白质表面上安装小而生物串管的反应性手柄。我们利用了反电子二极管的快速动力学和高选择性 - 评估四嗪苯丙氨酸（TETF）与紧张的反甲环烯 - 氯酸酯（STCO-CA）（STCO-CA）和跨循环链烯（TETR-caclecten）（TETR-CATRE）的反应（TETF）与TETRECANE（TETRE）（TETER-CARORE（TETRE）。生物缀合后，叶绿素配体暴露于释放酶标记，以通过简单的蛋白质印迹分析直接定量生物缀合。我们证明了该工具的多功能性，以快速，准确地确定不同UAA/氯烷烃对的生物缀合效率以及对不同蛋白质的不同位点（包括EGFP和雌激素相关的受体ERR）的不同位点。■简介
化学科学 - RSC 出版
为了针对特定的细胞器，目标分子通常与靶向单元结合，2,11 已在质膜、26 溶酶体、27 线粒体、28,29 和内质网 (ER) 中得到充分证实。30 但是，化学修饰可能会改变分子的性质，这是该方法的一个重要限制。或者，可以使用生物正交化学实现对细胞区室的特定靶向，31 – 33 其中目标分子可以在细胞中与靶分子（例如糖或脂质）发生反应，通常使用高效的“点击”反应。 34,35 此外，与蛋白质标签融合的靶蛋白，例如 SNAP-tag、36 CLIP-tag 37 和 HaloTag 38 可与相应的化学配体发生反应，从而允许将小分子（染料）靶向特定细胞器并对其局部特性进行成像。39,40 然而，这些方法利用本质上不可逆的反应，因此位于靶细胞器内的分子会发生化学修饰。是否有可能将同一分子靶向不同的特定细胞区室，同时在靶向过程之前和之后保留其天然化学结构？可以考虑利用动态共价化学通过与位于特定细胞区室的靶向配体发生原位反应来定位分子。在这种情况下，即使靶向到感兴趣的位点（细胞器），可逆过程也能确保未修饰物种的存在。动态共价化学是产生和打破共价键的有效方法
活细胞核凝聚体的平行蛋白质组学和转录组微环境图谱 (μMap)
摘要：细胞活动在空间上由不同的细胞器组织。虽然一些结构已被充分描述，但许多细胞器的作用尚不清楚。分析生物分子组成是理解功能的关键，但在小型动态结构的背景下很难实现。光邻近标记已成为映射这些相互作用网络的强大工具，但在活细胞应用中，最大限度地提高催化剂定位并降低毒性仍然具有挑战性。在这里，我们公开了一种具有最小细胞毒性和脱靶结合的新型细胞内光催化剂，我们利用这种催化剂进行基于 HaloTag 的微环境映射 (μ Map)，以在空间上对活细胞中的亚核凝聚物进行分类。我们还专门开发了一种新的以 RNA 为中心的工作流程 (μ Map-seq)，以实现这些结构的并行转录组学和蛋白质组学分析。在验证了我们的方法的准确性后，我们生成了跨核仁、核层、卡哈尔体、副斑和 PML 体的空间图。这些结果为 RNA 代谢和基因调控提供了潜在的新见解，同时显著扩展了 μ Map 平台，以改进生物系统中的活细胞邻近标记。■ 简介
一种用于复杂介质中分析物检测的基于纳米抗体的电化学传感器的访问策略
纳米抗体是从骆驼科动物中分离出来的单可变域抗体，由于其相对稳定性、易于生产和分离以及高结合亲和力，正迅速成为生物传感器中理想的识别元件。然而，实时传导纳米抗体与分析物的结合具有挑战性，因为大多数纳米抗体在识别目标时不会直接产生光或电信号。在这里，我们报告了一种制造灵敏且选择性的电化学传感器的通用策略，该传感器结合了纳米抗体，用于检测异质介质（例如细胞裂解物）中的目标分析物。石墨毡可以用重组 HaloTag 修饰的纳米抗体进行共价功能化。随后使用气相沉积工艺用一层薄薄的水凝胶进行封装，可获得封装电极，该电极在抗原结合时直接显示电流减少，而无需添加氧化还原介质。差分脉冲伏安法可在特定抗原浓度的多个电极样品中提供清晰且一致的电极电流减少。正如预期的那样，观察到的电流随抗原浓度增加而变化的情况遵循 Langmuir 结合特性。重要的是，未纯化的细胞裂解物中的选择性和可重复性靶标结合仅由封装电极证明，抗原检测限约为 30 pmol，而缺乏封装的裸电极在对照实验中会产生大量假阳性信号。© 2022 作者。由 IOP Publishing Limited 代表电化学学会出版。这是一篇开放获取的文章，根据知识共享署名 4.0 许可条款分发（CC BY，http://creativecommons.org/licenses/ by/4.0/ ），允许在任何媒介中不受限制地重复使用作品，前提是对原始作品进行适当引用。[DOI：10.1149/ 2754-2726/ac5b2e]