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KRAB-dCas9 + DNMT3 和 Ezh2-dCas9 + 可遗传基因沉默的决定因素
精准表观基因组编辑作为一种在不改变遗传信息的情况下调节基因表达的方法，已引起广泛关注。然而，一个主要的限制因素是基因表达变化往往是暂时的，不像自然界中经常发生的终生表观遗传变化。在这里，我们系统地探究了基于 CRISPR / dCas9 的表观基因组编辑器 (Epi-dCas9) 设计持久表观遗传沉默的能力。我们阐明了有助于表观遗传重编程差异稳定性的顺式调控特征，例如活跃转录组蛋白标记 H3K36me3 和 H3K27ac 分别与对短期抑制的抵抗力和对长期沉默的抵抗力密切相关。H3K27ac 与 DNA 甲基化的增加呈负相关。有趣的是，仅当使用 KRAB-dCas9 和可靶向 DNA 甲基转移酶 (DNMT3A-dCas9 + DNMT3L) 组合时才观察到对 H3K27ac 的依赖，而当用可靶向 H3K27 组蛋白甲基转移酶 Ezh2 替换 KRAB 时则未观察到。此外，可编程 Ezh2 / DNMT3A + L 处理显示出增强的局部 DNA 甲基化工程，并且对不同的染色质状态不敏感。我们的结果强调了局部染色质特征对于可编程沉默的遗传性的重要性以及对基于 KRAB 和 Ezh2 的表观遗传编辑平台的差异响应。本研究获得的信息为理解上下文线索以更可预测地设计持久沉默提供了基本见解。
KRAB-dCas9 + DNMT3 和 Ezh2-dCas9 + DNMT3 命中并逃逸表观基因组编辑的可遗传基因沉默决定因素
精准表观基因组编辑作为一种在不改变遗传信息的情况下调节基因表达的方法，已引起广泛关注。然而，一个主要的限制因素是基因表达变化往往是暂时的，不像自然界中经常发生的终生表观遗传变化。在这里，我们系统地探究了基于 CRISPR / dCas9 的表观基因组编辑器 (Epi-dCas9) 设计持久表观遗传沉默的能力。我们阐明了有助于表观遗传重编程差异稳定性的顺式调控特征，例如活跃转录组蛋白标记 H3K36me3 和 H3K27ac 分别与对短期抑制的抵抗力和对长期沉默的抵抗力密切相关。H3K27ac 与 DNA 甲基化的增加呈负相关。有趣的是，仅当使用 KRAB-dCas9 和可靶向 DNA 甲基转移酶 (DNMT3A-dCas9 + DNMT3L) 组合时才观察到对 H3K27ac 的依赖，而当用可靶向 H3K27 组蛋白甲基转移酶 Ezh2 替换 KRAB 时则未观察到。此外，可编程 Ezh2 / DNMT3A + L 处理显示出增强的局部 DNA 甲基化工程，并且对不同的染色质状态不敏感。我们的结果强调了局部染色质特征对于可编程沉默的遗传性的重要性以及对基于 KRAB 和 Ezh2 的表观遗传编辑平台的差异响应。本研究获得的信息为理解上下文线索以更可预测地设计持久沉默提供了基本见解。
技术数据表：U-87 mg DCAS9-KRAB单元线
图3。抑制p53和KRAS基因表达。慢病毒表达靶向p53和KRAS基因的GRNA用于感染U-87 mg DCAS9-KRAB细胞。慢病毒没有GRNA表达作为对照。感染后24小时，将抗生素添加到培养基中，以富集抗生素耐药细胞。细胞颗粒并进行DDPCR基因表达定量分析。在感染GRNA的细胞中，p53和KRAS基因的表达显着抑制。
![技术数据表：293 [HEK-293] DCAS9-KRAB单元线](/simg/5/5845441ceb850691992d55c908fa0d66f7f3a759.webp)
技术数据表：293 [HEK-293] DCAS9-KRAB单元线
图2。在293 [HEK-293] DCAS9-KRAB细胞（ATCC®CRL-1573DCAS9-KRAB™）中对基因表达敲低的验证。抑制p53和setD9基因表达。表达靶向p53和setD9基因的GRNA的慢病毒分别用于感染293 [HEK-293] DCAS9-KRAB细胞。慢病毒没有GRNA表达作为对照。感染后24小时，将抗生素添加到培养基中，以富集抗生素耐药细胞。细胞颗粒并进行DDPCR基因表达定量分析。p53基因的表达（左）和setD9基因（右）在感染GRNA的细胞中受到了显着抑制。