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利用非整合型Wus2载体增强玉米转化和定点诱变
摘要：高效的遗传转化是快速进行基因功能分析和作物性状改良的先决条件。我们最近证明，使用我们的快速农杆菌介导转化方法，具有 NptII /G418 选择和兼容辅助质粒的新型 T-DNA 双元载体可以有效地转化玉米自交系 B104。在这项工作中，我们实施了非整合型 Wuschel2 (Wus2) T-DNA 载体方法进行农杆菌介导的 B104 转化，并测试了其对难转化自交系 B73 转化和基因编辑的潜力。非整合型 Wus2 (NIW) T-DNA 载体辅助转化方法使用两株农杆菌菌株：一株携带目的基因 (GOI) 构建体，另一株提供 NIW 构建体。为了监测 Wus2 与玉米基因组的共整合，我们将由强组成型启动子驱动的玉米 Wus2 表达盒与新的可见标记 RUBY 相结合，后者产生紫色色素甜菜碱。作为 GOI 构建体，我们使用之前测试过的 CRISPR-Cas9 构建体 pKL2359 进行 Glossy2 基因诱变。当 GOI 和 NIW 构建体都由 LBA4404Thy 菌株递送时，B104 转化频率显著提高了约两倍（10% vs. 18.8%）。重要的是，我们能够使用 NIW 辅助转化方法转化顽固性自交系 B73，并通过省略选择剂 G418 获得了三株无转基因编辑植物。这些结果表明，NIW 辅助转化可以提高玉米 B104 转化频率，并为 CRISPR 技术用于无转基因基因组编辑提供一种新选择。
岩石栖息菌 Knufia petricola 的基因工程为极端耐受性黑真菌的生物学提供了见解
黑色微菌落真菌（来自 Arthonio-、Dothideo- 和 Eurotiomycetes 的子囊菌）是自然和人为极端栖息地中耐压力和持久的栖息者。它们表现出缓慢的酵母样或分生生长，不形成专门的生殖结构，并在多层细胞壁中积累黑色素 1,8-二羟基萘 (DHN) 黑色素。要了解黑色真菌如何生活、存活、在矿物基质上定殖以及与光养菌相互作用，需要使用遗传方法来测试这些功能和相互作用。我们选择了 Chaetothyriales 的岩石栖息菌 Knufia petricola 作为开发遗传操作方法的模型。在这里，我们报告了通过更高效的多重 CRISPR/Cas9 扩展遗传工具包的情况，使用基于质粒的系统表达 Cas9 和多个 sgRNA，并实施三个抗性选择标记 genR（遗传霉素/ nptII）、baR（草铵膦/ bar）和 suR（氯嘧磺隆/ sur）。通过替换色素合成必需基因有针对性地整合表达构建体，可以对转化体进行额外的颜色筛选。由于消除了 pks1（黑色素），黑粉色筛选被用于启动子研究，使用 GFP 荧光作为报告基因。由于同时消除了 pks1 和 phs1（类胡萝卜素），黑白筛选可以识别包含两个表达构建体的转化体，以进行共定位或双分子荧光互补 (BiFC) 研究。证实了两种 K. petricola White Collar 直系同源物的共定位和相互作用。确定了两个基因间区域 ( igr1 、 igr2 )，其中可以插入表达构建体而不会引起明显的表型。使用 pNXR-XXX 系列质粒和新的兼容入门质粒可以快速轻松地生成表达构建体，适合在其他真菌中广泛实施。这种遗传工具的多样性为黑真菌基因组编码的基因/蛋白质的表达、功能和调控的机制和非常详细的研究开辟了一个全新的视角。