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在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
纯化抗TFAM抗体
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TFAM缺乏会导致线粒体功能障碍和通过CGAS刺激途径增强的抗肿瘤免疫力
抽象的背景线粒体转录因子A（TFAM）是维持线粒体DNA（mtDNA）稳定并启动mtDNA复制的转录因子。然而，关于肿瘤中免疫细胞中免疫调节功能和TFAM表达知之甚少。使用小鼠肿瘤模型来分析TFAM缺乏对髓样细胞谱系对肿瘤进展和肿瘤微环境（TME）修饰的影响。在体外，原代小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）用于研究变化的功能和活化途径。ova用作模型抗原，以验证体内免疫反应的激活。sting抑制剂用于确认DC缺乏TFAM引起的刺激激活。导致DC中TFAM的缺失导致线粒体功能障碍和mtDNA胞质泄漏，从而导致DC中的CGAS丁字途径激活，这有助于增强的抗原表现。DC中TFAM的缺失有趣地逆转了免疫抑制性TME，并抑制了肿瘤模型中的肿瘤生长和转移。结论我们透露，DC中的TFAM敲除通过STING途径改善肿瘤中的免疫抑制微环境。我们的工作表明，DC中的特定TFAM敲除可能是设计新型免疫疗法方法的令人信服的策略。
以 CRISPR-Cas9 破坏 TFAM 的 HEK293T 细胞作为线粒体调控的模型
1 圣保罗大学动物科学与食品工程学院兽医学系，圣保罗 13635-900，巴西；kroballo@vt.vcom.edu (KCSR)；clesio.gmm@usp.br (CGMJ)；sarahingrid@usp.br (SIPS)；fabianabressan@usp.br (FFB)；ceambrosio@usp.br (CEA) 2 爱德华维亚骨科医学院，弗吉尼亚州布莱克斯堡 24060，美国 3 弗吉尼亚理工大学弗吉尼亚-马里兰兽医学院生物医学科学与病理学系，弗吉尼亚州布莱克斯堡 24060，美国 4 圣卡洛斯联邦大学遗传与进化系，圣卡洛斯 13565-905，巴西； chiarattimr@gmail.com 5 默多克儿童研究所，皇家儿童医院，墨尔本 3052，澳大利亚；elena.tucker@mcri.edu.au 6 墨尔本大学儿科系，墨尔本 3010，澳大利亚 7 斯坦利曼恩儿童研究所，芝加哥 Ann & Robert H. Lurie 儿童医院，伊利诺伊州芝加哥 60611，美国； eridavis@luriechildrens.org 8 美国西北大学范伯格医学院儿科系，伊利诺伊州芝加哥 1900，美国 9 美国西北大学范伯格医学院细胞与发育生物学系，伊利诺伊州芝加哥 1900，美国 10 法国国家自然历史博物馆基因组结构和不稳定性实验室，INSERM U1154，CNRS UMR7196，75231 巴黎，法国；jean-paul.concordet@mnhn.fr * 通信地址：van.oliveira@usp.br 或 van.cristina.oliveira@hotmail.com
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。