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以 CRISPR-Cas9 破坏 TFAM 的 HEK293T 细胞作为线粒体调控的模型
1 圣保罗大学动物科学与食品工程学院兽医学系，圣保罗 13635-900，巴西；kroballo@vt.vcom.edu (KCSR)；clesio.gmm@usp.br (CGMJ)；sarahingrid@usp.br (SIPS)；fabianabressan@usp.br (FFB)；ceambrosio@usp.br (CEA) 2 爱德华维亚骨科医学院，弗吉尼亚州布莱克斯堡 24060，美国 3 弗吉尼亚理工大学弗吉尼亚-马里兰兽医学院生物医学科学与病理学系，弗吉尼亚州布莱克斯堡 24060，美国 4 圣卡洛斯联邦大学遗传与进化系，圣卡洛斯 13565-905，巴西； chiarattimr@gmail.com 5 默多克儿童研究所，皇家儿童医院，墨尔本 3052，澳大利亚；elena.tucker@mcri.edu.au 6 墨尔本大学儿科系，墨尔本 3010，澳大利亚 7 斯坦利曼恩儿童研究所，芝加哥 Ann & Robert H. Lurie 儿童医院，伊利诺伊州芝加哥 60611，美国； eridavis@luriechildrens.org 8 美国西北大学范伯格医学院儿科系，伊利诺伊州芝加哥 1900，美国 9 美国西北大学范伯格医学院细胞与发育生物学系，伊利诺伊州芝加哥 1900，美国 10 法国国家自然历史博物馆基因组结构和不稳定性实验室，INSERM U1154，CNRS UMR7196，75231 巴黎，法国；jean-paul.concordet@mnhn.fr * 通信地址：van.oliveira@usp.br 或 van.cristina.oliveira@hotmail.com
纯化抗TFAM抗体
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在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
在牛模型中通过 CRISPR/Cas9 技术修饰 TFAM 基因的后编辑细胞的表征
为了增加知识，必须深入研究大型动物模型中的基因编辑，以便将来将其应用于转化医学和食品生产。线粒体转录因子 A（TFAM）是 HMGB 亚家族的成员，可与 mtDNA 启动子结合。该基因维持 mtDNA，并且对于 mtDNA 转录的起始至关重要。最近，我们通过 CRISPR/Cas 9 技术破坏牛成纤维细胞中的 TFAM 基因，生成了一种新的细胞系。我们通过生成杂合突变克隆证明了 CRISPR/Cas9 设计是有效的。在这种情况下，一旦该基因调节 mtDNA 复制特异性，该研究旨在确定后编辑细胞是否能够在体外维持，并评估它们在培养中连续传代后是否会出现 mtDNA 拷贝数和线粒体膜电位的变化。编辑后的细胞在培养中扩增，我们进行了生长曲线、倍增时间、细胞活力、线粒体 DNA 拷贝数和线粒体膜电位测定。编辑过程并没有使细胞培养变得不可行，尽管与对照组相比，细胞生长率和活力有所下降，因为我们观察到在补充有尿苷和丙酮酸的培养基中培养时，细胞生长良好。它们还表现出典型的成纤维细胞样外观。用于确定 mtDNA 拷贝数的 RT-qPCR 表明，与不同细胞代次中未编辑的克隆（对照）相比，编辑后的克隆有所减少。用 Mitotracker Green 和 red 进行细胞染色表明，与未编辑的细胞相比，编辑后的细胞中的红色荧光有所减少。因此，通过表征，我们证明了 TFAM 基因对于线粒体的维持至关重要，因为它会干扰不同细胞传代中线粒体 DNA 拷贝数和膜电位的稳定性，从而证实了杂合编辑的细胞中线粒体活性的降低。
TFAM缺乏会导致线粒体功能障碍和通过CGAS刺激途径增强的抗肿瘤免疫力
抽象的背景线粒体转录因子A（TFAM）是维持线粒体DNA（mtDNA）稳定并启动mtDNA复制的转录因子。然而，关于肿瘤中免疫细胞中免疫调节功能和TFAM表达知之甚少。使用小鼠肿瘤模型来分析TFAM缺乏对髓样细胞谱系对肿瘤进展和肿瘤微环境（TME）修饰的影响。在体外，原代小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）用于研究变化的功能和活化途径。ova用作模型抗原，以验证体内免疫反应的激活。sting抑制剂用于确认DC缺乏TFAM引起的刺激激活。导致DC中TFAM的缺失导致线粒体功能障碍和mtDNA胞质泄漏，从而导致DC中的CGAS丁字途径激活，这有助于增强的抗原表现。DC中TFAM的缺失有趣地逆转了免疫抑制性TME，并抑制了肿瘤模型中的肿瘤生长和转移。结论我们透露，DC中的TFAM敲除通过STING途径改善肿瘤中的免疫抑制微环境。我们的工作表明，DC中的特定TFAM敲除可能是设计新型免疫疗法方法的令人信服的策略。
线粒体 - 覆盖轴轴调节生存...
原理：基于干细胞的疗法已成为组织工程和再生医学的有前途的工具，但是它们的治疗疗效在很大程度上受到氧化应激诱导的受伤组织部位移植细胞的丧失的限制。为了解决这个问题，我们旨在探索ROS引起的MSC损失的潜在机制和保护策略。方法：使用实时PCR，Western blotting和RNA测序评估了TFAM（线粒体转录因子A）信号传导，线粒体功能，线粒体损伤，DNA损伤，凋亡和衰老。还分析了MSC中TFAM或LNCRNA核拼接组件的转录本1（Neat1）敲低或过表达对线粒体功能，DNA损伤修复，凋亡和衰老的影响。在肾脏缺血/再灌注（I/R）损伤的小鼠模型中评估了线粒体靶向抗氧化剂（mito-tempo）对移植MSC存活的影响。结果：线粒体ROS（MTROS）爆发导致TFAM信号传导和总体线粒体功能的缺陷，这进一步损害了Neat1表达及其介导的副夹层的形成和MSC中的DNA修复途径，从而在氧化应激下共同促进MSC衰减和死亡。相比之下，有针对性的抑制MTROS爆发是一种足够的策略，可以减轻受伤组织部位的早期移植MSC损失，而Mito-Tempo的共同给药可改善移植的MSC的局部保留和减少缺血性肾脏的氧化损伤。结论：本研究确定了线粒体 - 拼双轴在调节细胞存活中的关键作用，并可能为开发用于组织工程和再生医学的先进干细胞疗法提供见解。
evogliptin，一种DPP-4抑制剂，通过减轻DB/DB小鼠的心脏脂肪毒性来防止糖尿病心肌病
二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂是降糖药物的2型糖尿病（T2DM）。我们研究了DPP-4抑制剂Evogliptin®（EVO）是否可以预防糖尿病心肌病（DCM）和基本机制。每天通过口服饲料每天对EVO（100 mg/kg/day）进行八个星期大的糖尿病患者和肥胖的db/db小鼠12周。 DB/DB对照小鼠和C57BLKS/J作为野生型（wt）小鼠接受相等量的车辆。 除了降血糖作用外，我们还检查了通过EVO治疗的心脏收缩/放松能力，心脏纤维化和心肌肥大的改善。 通过EVO治疗来确定改善糖尿病心肌病的机制，其对脂肪毒性的影响以及由心肌中脂质液滴积累引起的线粒体损伤。 EVO降低了血糖和HBA1C水平，并提高了胰岛素敏感性，但不会影响体重或血脂性。 心脏收缩/舒张功能，肥大和纤维化在经过EVO治疗的组中得到改善。 EVO通过抑制CD36，ACSL1，FABP3，PPARGAMMA和DGAT1的抑制，并增强FOXO1的磷酸化，表明其抑制作用。 通过激活PGC1A/NRF1/TFAM，通过激活线粒体生物发生的PGC1A/NRF1/TFAM实现了线粒体功能的改善和损伤的减少。八个星期大的糖尿病患者和肥胖的db/db小鼠12周。DB/DB对照小鼠和C57BLKS/J作为野生型（wt）小鼠接受相等量的车辆。除了降血糖作用外，我们还检查了通过EVO治疗的心脏收缩/放松能力，心脏纤维化和心肌肥大的改善。通过EVO治疗来确定改善糖尿病心肌病的机制，其对脂肪毒性的影响以及由心肌中脂质液滴积累引起的线粒体损伤。EVO降低了血糖和HBA1C水平，并提高了胰岛素敏感性，但不会影响体重或血脂性。心脏收缩/舒张功能，肥大和纤维化在经过EVO治疗的组中得到改善。EVO通过抑制CD36，ACSL1，FABP3，PPARGAMMA和DGAT1的抑制，并增强FOXO1的磷酸化，表明其抑制作用。通过激活PGC1A/NRF1/TFAM，通过激活线粒体生物发生的PGC1A/NRF1/TFAM实现了线粒体功能的改善和损伤的减少。RNA-seq的整个心脏结果证实，EVO治疗主要影响与脂质代谢相关的差异表达基因（DEG）。总的来说，这些发现表明EVO通过降低脂肪毒性和线粒体损伤来改善心脏功能，并为DCM提供了潜在的治疗选择。
主题问题2020-2022-CN
摘要：大量证据表明，半自治细胞器线粒体在许多神经退行性疾病的进展中起关键作用。线粒体DNA（mtDNA）编码Oxphos复合物的成分，但突变的mtDNA用AGING积聚在细胞中，这反映了神经退行性疾病的患病率的增加。这种积累不仅源于mtDNA和高度氧化环境的修复，而且还源于裂变后的有效线粒体。In this review, we focus on several pivotal mitochondrial proteins related to mtDNA maintenance (such as ATAD3A and TFAM), mtDNA alterations including mtDNA mutations, mtDNA elimination, and mtDNA release-activated inflammation to understand the crucial role played by mtDNA in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Alz- heimer's disease,帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化和亨廷顿氏病。我们的工作概述了针对mtDNA的新型治疗策略。
无症状和有症状 COVID-19 患者血浆线粒体 DNA 拷贝数比较
简介：自 COVID-19 大流行开始以来，已报告 COVID-19 患者的临床表现范围广泛，从无症状感染到轻度或重度疾病和死亡。研究表明了几种可能影响 COVID-19 临床结果的因素。促炎状态和抗病毒反应受损被认为是重症 COVID-19 的主要促成因素。考虑到线粒体在调节对病原体的免疫反应、促炎信号传导和细胞死亡方面发挥着重要作用，它在 SARS-CoV-2 感染中受到了广泛关注。最近的研究表明，高水平的无细胞线粒体 DNA（cf-mtDNA）与 COVID-19 重症监护病房 (ICU) 入院和死亡风险增加有关。然而，关于 SARS-CoV-2 感染中 cf-mtDNA 的研究很少，主要集中于重症 COVID-19 病例。在本研究中，我们调查了 COVID-19 患者的 cf -mtDNA 拷贝数，并比较了无症状病例和有症状病例，并评估了临床价值。我们还确定了研究组中的 cf -核 DNA (cf -nDNA) 拷贝数和线粒体转录因子 A (TFAM) mRNA 水平。
小线粒体的神经保护作用......
神经线粒体功能障碍、神经氧化应激、慢性神经炎症、毒性蛋白质积累和神经细胞凋亡是神经退行性疾病的常见原因。Elamipretide 是一种针对线粒体的小四肽，在多种线粒体相关疾病中表现出治疗效果和安全性。在神经退行性疾病中，大量研究表明，elamipretide 可增强线粒体呼吸，通过线粒体生物合成调节剂 (PCG-1 α 和 TFAM) 和转位因子 (TOM-20) 激活神经线粒体生物合成，增强线粒体融合 (MNF-1、MNF-2 和 OPA1)，抑制线粒体分裂 (Fis-1 和 Drp-1)，以及增加线粒体自噬 (线粒体的自噬)。此外，埃拉米普利肽已被证明可以减轻神经氧化应激（过氧化氢、脂质过氧化和 ROS）、神经炎症（TNF、IL-6、COX-2、iNOS、NLRP3、裂解 caspase-1、IL-1 β 和 IL-18）和毒性蛋白质积累（A β ）。因此，埃拉米普利肽可以预防神经细胞凋亡（细胞色素 c、Bax、胱天蛋白酶 9 和胱天蛋白酶 3）并增强神经退行性疾病中的神经促存活（Bcl2、BDNF 和 TrkB）。这些发现表明，埃拉米普利肽可能通过增强线粒体呼吸、线粒体生物合成、线粒体融合和神经促存活途径，以及抑制线粒体分裂、氧化应激、神经炎症、毒性蛋白质积累和神经细胞凋亡来预防神经退行性疾病的逐渐发展。埃拉米普利肽或线粒体靶向肽可能是减缓神经退行性疾病进展的靶向药物。