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使用内源性 U6 snRNA 启动子驱动的 CRISPR/Cas9 sgRNA 在核盘菌中进行有效的基因组编辑
我们之前报道了一种针对死体营养真菌植物病原菌核病菌的 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统。该系统（TrpC-sgRNA 系统）基于 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）启动子（TrpC）在体内驱动 sgRNA 转录，成功创建了基因插入突变体。然而，相对低效率的靶向基因编辑阻碍了该方法在核病菌功能基因组研究中的应用。为了进一步优化 CRISPR-Cas9 系统，建立并评估了无质粒的 Cas9 蛋白/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）介导的系统（RNP 系统）和基于质粒的 RNA 聚合酶 III 启动子（U6）驱动的 sgRNA 转录系统（U6-sgRNA 系统）。本研究针对之前鉴定的草酰乙酸乙酰水解酶 (Ssoah1) 基因座和一个编码聚酮化合物合酶 12 (Sspks12) 的新基因座创建了功能丧失突变体。RNP 系统与我们之前报道的 TrpC-sgRNA 系统类似，可以在 Ssoah1 基因座上以类似的效率产生突变。然而，这两个系统都未能在 Sspks12 基因座上成功产生突变。U6-sgRNA 系统在这两个基因座上都表现出明显更高的基因突变效率。该技术为靶向基因突变提供了一种简单有效的策略，从而将加快对这种具有重要经济价值的植物病原体的致病性和发展的研究步伐。
扩展库蚊的 CRISPR 工具箱
摘要：基于 CRISPR − Cas9 的“基因驱动”技术已被提议作为一种新颖且有效的控制蚊子传播的人类疾病的方法。然而，需要比迄今为止展示的更复杂的设计以及构建它们的扩展分子工具箱以克服抗药性形成/进化和驱动空间/时间限制的问题。预见到这种需求，我们使用三种与疾病相关的库蚊细胞系（埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊）评估了 33 种系统发育不同的昆虫聚合酶 III 启动子的 sgRNA 转录活性。我们表明 U6 启动子可在具有一系列转录活性水平的物种中发挥作用，并且发现 7SK 启动子由于其广泛的系统发育活性而特别有前景。我们进一步表明，U6 启动子可以被大幅截短而不会影响转录水平。这些结果对于参与开发下一代基因驱动的研究人员将具有重要意义。关键词：聚合酶 III、Cas9、U6 启动子、7SK 启动子、基因驱动、蚊子
CRISPR稳定的敲入细胞生产（CAT。C.C408）案例研究：使用CRISPR将红色荧光蛋白（RFP）基因敲入人类胚胎
图2 PCAS-GUIDE-AAVS1和PAAVS1-RFP-DNR的矢量图。pCAS指向AAVS1是哺乳动物细胞中SGRNA和Cas9共表达的多合一载体。SGRNA的表达是由强大的组成型Pol III启动子U6启动子驱动的。而CMV启动子则驱动CAS9酶的表达。paAVS1-RFP-DNR在CMV启动子下的PGK启动子和RFP基因下表达紫霉素的抗性标记。5'和3'AAVS1同源臂（“ aavs-right”和“ aavs-left”）为单元提供了一个用于同源性修复的模板。
目录 - 美洲国家组织
a. 高地和火山活动（U1） b. 高地和地震（U2） c. 高地和山体滑坡（U3） d. 高地和飓风（U4） e. 高地和陆地/海洋洪水（U5） f. 高地和沙漠化（U6） g. 低地和陆地/海洋洪水（L5） h. 低地和沙漠化（L6） i. 河口和飓风（E4） j. 河口和陆地/海洋洪水（E5） k. 礁石和飓风（R4） l. 礁石和陆地/海洋洪水（R5） m. 公海和飓风（S4） n. 公海和陆地/海洋洪水（S5）
暑期课堂上通过视觉选择对果蝇进行 CRISPR/Cas9 基因编辑
(A) 顶部：将目标 Gal4（深蓝色，顶部构建体）与编码 Cas9 的版本 2 (V2) 供体菌株杂交，该菌株由 X 上的 vasa 启动子控制（未显示），而 CyO 上的供体构建体则包含 T2A。LexA 由 floxed 3xP3-RFP、黄色+ 盒标记，两侧是 Gal4 同源臂和 U6 驱动的向导 RNA（CyOHACKy.V2,y +、RFP +）。从上往下第三行：得到的 HACKed 染色体，其中 Gal4 ORF 已被破坏并由 T2A.LexA 替换，由视觉标记黄色+和 RFP+标记。底部：与 hs- Cre 杂交后，黄色 +、RFP + 盒被移除。
Mukherjee_ASGCT USH2A 海报_最终版
图 1：EDIT-102 的作用机制。*USH2A 基因中的 Ex13 代表导致 IRD 的任何外显子 13 突变，包括 c.2299delG。EDIT-102 编码人类 U6 启动子、向导 RNA（gRNA；RSQ9145 和 RSQ9265）、hGRK1 启动子、SV40（猿猴病毒 40）SD/SA（剪接供体/剪接受体）序列元素、NLS（核定位序列）、Sa（金黄色葡萄球菌）Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）和 pA（多聚腺苷酸化信号）。EDIT-102 在 USH2A 外显子 13 的两侧进行编辑，导致外显子 13 从基因组和 mRNA 中去除，从而产生缺乏氨基酸 723-936 的功能性 Usherin 蛋白。
在鼠感染模型中发现具有功效的SARS-COV-2蛋白酶样蛋白酶（PLPRO）抑制剂
图4。AFUPMV-1M感染的A. fumigatus的蛋白质组改变了。在生理和氧化应激条件下，使用质谱法（MS）表征了Fumigatus AF293和环己酰亚胺病毒（VC）的蛋白质含量。a。通过其存在/不存在鉴定蛋白的分布。只有每组3个三分之一（n = 3）中出现的蛋白质出现在最终列表中。b。通过方差分析（ANOVA）的未校正值<0.05（ANOVA），总共有117种蛋白质在菌株和生长条件下具有差异性丰富。c。在对照条件下以及通过QRT-PCR分析的对照条件下以及氧化挑战（5 mM H 2 O 2，4H）下，AF293与VC和RI的相对mRNA水平。分析的基因：BRF1，pol III transcranced Genes：U6 snRNA（U6），tRNA-arg（arg），tRNA-phe（phe）和tRNA-phe（phe）和tRNA-tyr（tyr），pol i-pol i-transciped procyclin（proc）。数据是平均 + s.e.m.，n = 3。** = 0.0085，*** = 0.0002，**** <0.0001。d。通过QRT-PCR分析，AF293与VC和RI的相对MIS6水平相对于VC和RI（5 mM H 2 O 2，4H）。数据是平均 + s.e.m，n = 3。e。 5天后，在使用10 mM羟基脲的固体GMM培养基上抑制生长。gmm用作对照。f-g。有丝分裂测定。分生孢子5小时，然后在指定的时间段内在YG培养基中再次洗涤并再次孵育。**** <0.0001。通过Hoechst染色和光学显微镜评估每个分生孢子（F）和分生孢子直径（G）中核的数量（每次重复计数50种生殖，这是三个独立实验±SD的平均值）。分生孢子悬浮液，以说明每个实验之前的分生孢子生存力差异。