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基因组编辑项目设计的一般准则和实用技巧.docx
方法。第一种方法是将含有 loxP 位点的 ssODN 引入目标外显子两侧的 5' 和 3' 位点。这是通过使用 2 个 sgRNA 完成的。第二种方法使用含有 2 个 loxP 位点的 lssDNA 模板，这 2 个 loxP 位点位于目标 DNA 序列两侧。这种方法使用了 2 个 sgRNA。B. UTSW 转基因核心提供给您的试剂：您向核心支付的 CRISPR 服务费用包括我们用于完成您的项目的 IDT Sp. Cas9 蛋白的费用。如果您的项目涉及使用不同的编辑酶（如 Cas12 或 Cpf），请联系核心工作人员更详细地讨论该项目。C. 了解您的基因的重要细节：使用基因组浏览器（如 NCBI、UCSC 或 ENSEMBl）收集有关您的目标基因的相关信息。这包括任何替代转录本、外显子的数量和重要性、位于特定内含子中的调控基序以及编码序列等细节，以便成功设计 sgRNA 和供体 DNA 模板。使用 MGI- 小鼠基因组信息学来确定是否存在与靶基因敲除相关的已知表型非常重要。了解基因的 KO 是否可能导致致命表型（无论是胚胎还是出生后早期）尤为重要。了解并将此信息传达给核心人员将使我们能够修改用于生成小鼠突变株的条件，以便我们主要创建 KO 等位基因杂合的小鼠。D. sgRNA 的设计：注射受精卵中发生的基因组编辑的效率在很大程度上取决于针对靶标的 sgRNA 的正确设计。此设计的关键组成部分包括：
DNA语言模型是基因组的有力预测指标 -
全基因组关联研究的扩展目录（GWAS）提供了各种物种的生物学知识，但是识别这些关联背后的因果变异仍然是一个重大挑战。实验验证既是劳动密集型又昂贵的验证，强调了需要准确，可扩展的计算方法来预测整个基因组遗传变异的影响。受到自然语言处理的最新进展的启发，在大型蛋白质序列数据库中无监督的预训练已证明在提取与蛋白质有关的复杂信息方面取得了成功。这些模型展示了使用无监督方法在编码区域中学习变异效应的问题。扩展了这一想法，我们在这里介绍了G Innomic P重新训练的N ETWORK（GPN），该模型旨在通过对基因组DNA的无监督预训练来学习全基因组变体效应。我们的模型还成功地学习了基因结构和DNA基序，而无需进行任何关注。为了证明其效用，我们对Arabidopsis thaliana的不和谐参考基因组进行了训练，在铜管序内训练了七个相关物种，并评估了其对拟南芥中植物变异的功能影响的abil，通过利用来自1001 Genomes genomes Project的拟南芥的功能影响。值得注意的是，GPN的表现优于基于流行的保护分数，例如门类和PHASTCON的预测因子。我们对拟南芥的预测可以可视化为UCSC基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/s/gbenegas/gbenegas/gpn-arabidopsis）中的序列徽标。我们仅使用其DNA序列提供代码（https://github.com/songlab-cal/gpn）为任何给定的物种训练GPN，从而实现了整个基因组中对变异效应的无监督预测。
果蝇 Myc 直系同源基因模型
(A) 果蝇 (Drosophila melanogaster) 和菠萝蜜 (D. ananassae) 中 Myc 基因组邻域的同源性比较。细箭头表示果蝇 (D. melanogaster) (顶部) 和菠萝蜜 (D. ananassae) (底部) 中目标基因 Myc 所在的 DNA 链。指向右侧的细箭头表示 Myc 在菠萝蜜 (D. ananassae) 和果蝇 (D.melanogaster) 中位于正 (+) 链上。指向与 Myc 相同方向的宽基因箭头相对于细箭头位于同一链上，而指向 Myc 相反方向的宽基因箭头相对于细箭头位于相反链上。果蝇 (D. ananassae) 中的白色基因箭头表示与果蝇 (D. melanogaster) 中相应基因的直系同源性。 D. ananassae 基因箭头中给出的基因符号表示 D. melanogaster 中的直系同源基因，而基因座标识符特定于 D. ananassae。（B）GEP UCSC Track Data Hub 中的基因模型（Raney 等人，2014 年）。D. ananassae 中 Myc 的编码区显示在用户提供的 Track（黑色）中；CDS 用粗矩形表示，内含子用细线表示，箭头表示转录方向。后续证据轨迹包括 NCBI RefSeq 基因的 BLAT 比对（深蓝色，D. ananassae 的 Ref-Seq 基因比对）、D. melanogaster 蛋白质的 Spaln（紫色，D. melanogaster 的 Ref-Seq 蛋白质比对）、TransDecoder 预测的转录本和编码区（深绿色）、成年雌性、成年雄性和沃尔巴克氏体治愈胚胎的 RNA-Seq（分别为红色、浅蓝色和粉色；D. ananassae 的 Illumina RNA-Seq 读数比对）以及使用 D. ananassae RNA-Seq 由 regtools 预测的剪接点（Graveley 等人，2011；SRP006203、SRP007906；PRJNA257286、PRJNA388952）。显示的剪接点的读取深度 >1000，支持读取为红色。（C）果蝇 Myc-PB 的点图（x 轴）与
针对提交概念的研究人员的 I-SPY 2 TRIAL 描述
• Neratinib + 同步对照 – 靶向外显子组测序 (2000 癌症基因面板) (合作者 Voest/Bernards,NKI)- T0 时间点 • Veliparib (ABT-888) + 同步对照 – RNA-seq (合作者- Pourmand, UCSC)，T0，T1 时间点 I-SPY 2 试验的任何数据或生物样本的生物样本和数据访问请求均受概念提交流程的约束。请求应使用 I-SPY 2 概念提案表进行，如下所述。 • I-SPY 2 概念的开发应涉及与 I-SPY 2 TRIAL 生物标志物主席 (Laura van 't Veer)、科学项目经理 (Gillian Hirst) 和统计学家 (Denise Wolf/Christina Yau) 进行多次讨论，以评估其在数据和样本可用性方面的可行性、与其他提案和计划相比的科学价值以及任何合同或预算要求。 • 概念开发在每月的 I-SPY 2 TRIAL 生物标志物工作组中讨论，并为研究人员提供了一个展示初步数据和完善概念提案的机会。 • 最终概念将由 I-SPY2 TRIAL 数据访问和出版委员会 (DAPC) 评估，然后才能采取进一步行动。（详情见下文） • 在考虑样本或数据访问时，请记住，特定组的数据和生物样本只有在研究药物不再参与试验时才可用，并且还取决于试验的出版优先级。仅数据请求 数据请求应使用标准 I-SPY 2 概念提案表提交。有可用的 I-SPY 2 统计模板，并且有 I-SPY 2 统计员可供咨询。只有在某个组退出试验后才会发布数据。请尽可能详细地填写统计计划，并在请求中清晰简洁地说明具体数据变量和时间点。目前，标准检测数据仅在 T0 时间点可用，但 RNA-seq 数据除外，该数据已在 2 个时间点在 veliparib 组中执行（见上文）。标准数据请求示例
果蝇 yakuba 中 eIF4E1 直系同源物的基因模型
(A) 果蝇 (Drosophila melanogaster) 和果蝇 (D. yakuba) 中 eIF4E1 基因组邻域的同源性比较。细箭头表示果蝇 (D. melanogaster) (顶部) 和果蝇 (D. yakuba) (底部) 基因组中参考基因 eIF4E1 所在的 DNA 链。指向右侧的细箭头表示 eIF4E1 在果蝇 (D. melanogaster) 中位于正 (+) 链上，指向左侧的细箭头表示 eIF4E1 在果蝇 (D. yakuba) 中位于负 (-) 链上。指向与 eIF4E1 相同方向的宽基因箭头相对于细箭头位于同一链上，而指向与 eIF4E1 相反方向的宽基因箭头相对于细箭头位于相反链上。果蝇 (D. yakuba) 中的白色基因箭头表示与果蝇 (D. melanogaster) 中相应基因的直系同源。 D. yakuba 基因箭头中给出的基因符号表示 D. melanogaster 中的直系同源基因，而基因座标识符特定于 D. yakuba。（B）GEP UCSC Track Data Hub 中的基因模型（Raney 等人，2014 年）。D. yakuba 中 eIF4E1 的编码区显示在用户提供的 Track（黑色）中；CDS 用粗矩形表示，内含子用细线表示，箭头表示转录方向。后续证据轨迹包括 NCBI RefSeq 基因的 BLAT 比对（深蓝色，D. yakuba 的 Ref-Seq 基因比对）、D. melanogaster 蛋白质的 Spaln（紫色，D. melanogaster 的 Ref-Seq 蛋白质比对）、TransDecoder 预测的转录本和编码区（深绿色）、成年雌性和成年雄性的 RNA-Seq（分别为红色和浅蓝色；D. yakuba 的 Illumina RNA-Seq 读段比对）以及使用 D. yakuba RNA-Seq (SRP006203 - Graveley et al, 2010) 通过 regtools 预测的剪接点。显示的剪接点分别具有 232、500-999 和 >1000 的读取深度，支持读取为粉色、棕色和红色。 (C) 果蝇 (D. melanogaster) 中的 eIF4E1-PB (x 轴) 与果蝇 (D. yakuba) 中的直系同源肽 (y 轴) 的点图。左侧和底部表示氨基酸编号；顶部和右侧表示 CDS 编号，CDS 也以交替颜色突出显示。序列相似性降低的区域用红色圈出。 (D) 果蝇 (D. melanogaster) 中的 eIF4E1-PC (x 轴) 与果蝇 (D. yakuba) 中的直系同源肽 (y 轴) 的点图。序列相似性降低的区域用红色圈出。
果蝇 Pten 直系同源基因模型
(A) 果蝇 (Drosophila melanogaster) 和果蝇 (D. miranda) 中 Pten 基因组邻域的同源性比较。细箭头表示果蝇 (D. melanogaster) (上) 和果蝇 (D. miranda) (下) 中目标基因 Pten 所在的 DNA 链。指向右侧的细箭头表示 Pten 在果蝇 (D. miranda) 中位于正 (+) 链上，指向左侧的细箭头表示 Pten 在果蝇 (D. melanogaster) 中位于负 (-) 链上。指向与 Pten 相同方向的宽基因箭头相对于细箭头位于同一链上，而指向 Pten 反方向的宽基因箭头相对于细箭头位于反链上。果蝇 (D. miranda) 中的白色基因箭头表示与果蝇 (D. melanogaster) 中相应基因直系同源，而黑色基因箭头表示非直系同源。灰色箭头表示在两个基因组邻域中都存在但不是同源的基因（在本例中为 Ror），在 D. miranda 中位于 Pten 的上游，但在 D. melanogaster 中位于 Pten 的下游。D. miranda 基因箭头中给出的基因符号表示 D. melanogaster 中的直系同源基因，而基因座标识符是 D. miranda 特有的。（B）GEP UCSC Track Data Hub 中的基因模型（Raney 等人，2014）。D. miranda 中 Pten 的编码区显示在用户提供的轨道（黑色）中；CDS 用粗矩形表示，内含子用细线表示，箭头表示转录方向。后续证据轨迹包括果蝇 (D. melanogaster) 蛋白质的 Spaln（紫色，果蝇 (D. melanogaster) 的 Ref-Seq 蛋白质比对）、NCBI RefSeq 基因的 BLAT 比对（深蓝色，果蝇 (D. miranda) 的 Ref-Seq 基因比对）、TransDecoder 预测的转录本和编码区（深绿色）、成年雌性和成年雄性的 RNA-Seq（分别为红色和浅蓝色；果蝇 (D. miranda) 的 Illumina RNA-Seq 读段比对）以及使用果蝇 (D. miranda) RNA-Seq (SRP009365) 由 regtools 预测的剪接点。所示的剪接点具有最小读取深度 10，其中 10-49、50-99 和 100-499 支持读取分别以蓝色、绿色和粉色表示。 (C) 果蝇 Pten-PB（x 轴）与果蝇直系同源肽（y 轴）的点图。左侧和底部标明氨基酸编号；顶部和右侧标明 CDS 编号，CDS 也以交替颜色突出显示。点图中的间隙表示序列相似性较低的区域。
pontocerebellar垂体下面板序列分析和外显子级缺失/重复测试19个基因面板基因列表ampd2，cask，chmp1a*，exos
pontocerebellar促发育不足序列序列分析和外显子级缺失/重复测试19个基因面板基因列表ampd2，cask，chmp1a*，exosc3，exosc3，ophn1，rars2，rars2，rars2，rars2，reln，reln，reln，sepsecs，sepsecs，sepsecs，sepsecs，sepsecs，tsen2，tsen2，tsen15，tsen1111a11a11a11a11a11a， TUBB2B，TUBB3，VLDLR，VPS53，VRK1 *只能检测到CHMP1A和TUBA1A基因临床特征Pontocerebellar低位症（PCH）的大删除/复制，这是一种罕见的疾病，是一种罕见的疾病，影响了ventral Pons and Cerebellum，两种结构，在两个结构中都在linea中发挥了相同的发育。PCH在大多数情况下都有胎儿发作，并且似乎是由于发育缺陷和小脑的进行性萎缩的结合而引起的。1-4由于子宫内发作和PON的参与，PCH可以与其他异常小脑发育障碍区分开，这些异常是由于产前感染，血管异常，退行性疾病，退化性疾病，或代谢异常而引起的。 PCH有三种主要类型。 1型PCH是一种婴儿致死型，会影响脊髓中的前角细胞，并引起脊柱肌肉萎缩，肌张力低下，染色和小头畸形。 2型PCH显示了脊柱运动神经元的保留，其特征是发育延迟，语言障碍，吞咽困难，进行性小头畸形和肌张力障碍或唱片。 在2型PCH中，还可以看到滋补性持续性癫痫发作，呼吸异常，低血压，共济失调和眼动异常。 4型PCH与2型PCH相似但更严重，受影响的儿童患有染色，严重的广泛性克隆和呼吸衰竭，导致新生儿时期死亡。1-4由于子宫内发作和PON的参与，PCH可以与其他异常小脑发育障碍区分开，这些异常是由于产前感染，血管异常，退行性疾病，退化性疾病，或代谢异常而引起的。PCH有三种主要类型。1型PCH是一种婴儿致死型，会影响脊髓中的前角细胞，并引起脊柱肌肉萎缩，肌张力低下，染色和小头畸形。2型PCH显示了脊柱运动神经元的保留，其特征是发育延迟，语言障碍，吞咽困难，进行性小头畸形和肌张力障碍或唱片。滋补性持续性癫痫发作，呼吸异常，低血压，共济失调和眼动异常。4型PCH与2型PCH相似但更严重，受影响的儿童患有染色，严重的广泛性克隆和呼吸衰竭，导致新生儿时期死亡。其他形式的PCH极为罕见，除了小脑发育不全外，还包括可变的临床体征。在PCH的鉴别诊断中，经常考虑小脑发育不全疾病。这些可能包括X连接的小脑发育不全疾病，而无需一致的POS参与，这也可以伴随着智力障碍（XLID），肌畸形，小头畸形和癫痫病。此外，常染色体显性微管蛋白相关的疾病存在多种脑畸形，包括小脑发育不全，是由异常的神经元迁移，分化和轴突指导引起的。5-7遗传学尚不清楚PCH的发生率。 这组疾病表现为常染色体主导，隐性或X连接的主要特征。 神经放射学表现，发病年龄和随附的临床体征通常足够不同，以允许PCH类型的临床分类并与分子诊断相关。 1-4 PCH尽管存在遗传异质性，但通常表现为真正的门德尔特征，但目前的文献表明，由于某些基因中的致病变异，可以看到临床异质性。 GenEDX的pontocerebellar发育不全面板包括对18个基因的测序和缺失/重复分析。 这些基因编码各种蛋白质，包括涉及微管组装的蛋白质（TUBB基因），转移RNA剪接蛋白复合物（TSEN基因）的成分以及负责所有线粒体蛋白（RARS2）翻译的转移RNA合成酶。 在Illumina平台上同时对富集的目标同时测序。5-7遗传学尚不清楚PCH的发生率。这组疾病表现为常染色体主导，隐性或X连接的主要特征。神经放射学表现，发病年龄和随附的临床体征通常足够不同，以允许PCH类型的临床分类并与分子诊断相关。1-4 PCH尽管存在遗传异质性，但通常表现为真正的门德尔特征，但目前的文献表明，由于某些基因中的致病变异，可以看到临床异质性。GenEDX的pontocerebellar发育不全面板包括对18个基因的测序和缺失/重复分析。这些基因编码各种蛋白质，包括涉及微管组装的蛋白质（TUBB基因），转移RNA剪接蛋白复合物（TSEN基因）的成分以及负责所有线粒体蛋白（RARS2）翻译的转移RNA合成酶。在Illumina平台上同时对富集的目标同时测序。使用来自提交样品的基因组DNA，该面板上基因的完整编码区域和剪接位点连接的测试方法富含GenEDX开发的专有靶向捕获系统，用于使用CNV调用（NGS-CNV）进行下一代测序。双向序列读取是基于NCBI refSEQ转录本的参考序列组装并对齐的，并且人类基因组构建了GRCH37/UCSC HG19。基因特异性过滤后，分析数据以识别涉及编码