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一种用于体内基因组编辑的新型紧凑型 Cas12a 变体
为了使通过腺相关病毒 (AAV) 载体进行的基因治疗取得成功，载体基因组大小是一个主要制约因素，因为它会阻止将较大的转基因包装到二十面体病毒衣壳中。在基于 CRISPR 的基因组编辑背景下，已经描述了多种紧凑型 Cas 变体，例如 Cas12j (CasPhi) 或 Cas12f (CasMINI) [ 1 , 2 ]，它们可用于通过 AAV 递送进行体内基因组编辑。在 Wang 等人的研究中 [ 3 ]，一种来自丹毒菌 (EbCas12a) 的新型紧凑型 Cas12a 变体被表征为当通过点突变 (enEbCas12a) 改进时，显示出与其他 Cas12a 变体相似的编辑效率 [ 3 ]。值得注意的是，EbCas12a 的编码序列比下一个更大的已表征 Cas12a 变体小约 150 bp（图 1），有利于将其容纳在“一体化” AAV 载体中，该载体在单个 AAV 模板上提供 Cas12a 和 crRNA。通过使用单一载体给药，作者证明了新型 AAV-enEbCas12a 载体介导体内基因组编辑的能力，从而为不断扩展的 CRISPR 工具箱增加了一个新条目。首先，作者通过体外切割试验表征了 EbCas12a，并确定 TTTV（V = G、C 或 A）为 PAM 序列，这与其他已报道的 Cas12a 系统类似。接下来，EbCas12 被证明在培养的哺乳动物细胞中具有功能性，这通过两个报告基因和各种基因组位点的切割得到证实。然而，与其他 Cas12a 变体（例如常用的 AsCas12a 和 LbCas12a）相比，EbCas12a 效率较低。因此，为了放宽 PAM 序列限制并提高 AsCas12a 的编辑效率，作者们在 EbCas12a 中替换了一个氨基酸，以建立 PAM 近端 DNA 接触，从而产生了变体 enEbCas12a。事实上，这种单点突变将基因组位点的编辑效率提高了约 2 倍。然而，与此同时，放宽 PAM 序列限制可能会增加 enEbCas12a 脱靶编辑的风险。为了通过实验检验这一担忧，对脱靶编辑事件进行了全基因组分析。值得注意的是，检测到的脱靶位点数量为
用于靶标表达和药物的先进体外平台...
图 5. 使用 Nanostring IO360 面板显示药物治疗调节了对细胞毒性有反应的患者的分子免疫特征。A. 与 IgG 对照（左侧）相比，用 NMC-521（右侧）治疗的所有患者肿瘤的治疗后通路富集分析（log 2 正常 RNA 计数）。热图清楚地说明了与 IgG 对照相比，NMC-521 响应于免疫活性相关通路（高 NES 评分）的强劲激活和细胞存活通路的减少。B. Nivolumab、NMC-521 及其组合持续升高了图 4 中确定的对细胞毒性有反应的患者的 CD8 + T 细胞和 NK 细胞相关 RNA 的 RNA 计数。与单独使用 nivolumab 相比，NMC-521 和联合治疗均显示出增强这些细胞特征的更强效力。
尽管中和活性较差，但仍在体内感染 CoV-2
利益冲突：MSD 是 Inbios、Vir Biotechnology、Ocugen、IntegerBio、Moderna、Merck 和 GlaxoSmithKline 的顾问或顾问。OZ 和家族拥有 Moderna 的股票。Diamond 实验室已从 Moderna、Vir Biotechnology、Emergent BioSolutions 和 IntegerBio 的赞助研究协议中获得无关的资金支持。Ellebedy 实验室已从 Moderna、Emergent BioSolutions 和 AbbVie 的赞助研究协议中获得资金。AHE 已从 InBios International, Inc、Fimbrion Therapeutics、RGAX、Mubadala Investment Company、Moderna、Pfizer、GlaxoSimthKline、Danaher、Third Rock Ventures、Goldman Sachs 和 Morgan Stanley 获得咨询费和演讲费；是 ImmuneBio Consulting 的创始人，并从与 Leyden Laboratories BV 的许可协议中获得与当前研究中提供的数据无关的版税。 JST 和 AHE 是与 Abbvie 签订的许可协议的特许权使用费的获得者，该协议与本研究中提供的数据无关。JST 已从 Curevac 收取咨询费。
基于脂质纳米粒子的核糖核蛋白递送用于体内基因组编辑
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关 (Cas) 系统是一种通过 DNA 修复机制进行位点特异性基因破坏、修复和基因组 DNA 修饰的技术，有望成为治疗传染病和遗传疾病的基本治疗策略。对于临床应用，基于非病毒载体的 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 递送非常重要，但递送效率低和缺乏实用的制造方法仍然是一个问题。我们在此报告了一种基于脂质纳米颗粒 (LNP) 的 Cas RNP 递送系统的开发，该系统基于优化设计的单链寡核苷酸 (ssODN)，可实现高效的体内基因组编辑。序列特异性 RNP-ssODN 复合物的形成被发现对于 RNP 的功能性递送很重要。此外，sgRNA 和 ssODN 之间的熔化温度 (Tm) 对体内基因敲除效率有显著影响。具有高 Tm 的 ssODN 导致有限的敲除 (KO) 活性，而接近室温的 ssODN 显示出最高的 KO 活性，这表明 RNPs 的细胞质释放非常重要。连续两次静脉注射 Tm 优化的配方分别在 DNA 和蛋白质水平上实现了约 70% 和 80% 的转甲状腺素蛋白 KO，且没有任何明显的毒性。这些发现对安全的体内 CRISPR/Cas RNP 递送技术的开发及其在基因组编辑疗法中的实际应用具有重要贡献。
基因编辑剂的治疗性体内递送
精确操纵和编辑人类细胞 DNA 序列的能力可以催生出强大的新型基因组药物。全球有数百万人患有遗传性疾病（Korf 等人，2019 年），其根本原因原则上可以通过治疗性 DNA 编辑剂来纠正。虽然传统的基因增强疗法可以通过提供基因的功能性副本来治疗某些常染色体隐性或单倍体不足性疾病，但基因编辑疗法可以直接纠正基因组 DNA 中的致病突变。因此，原则上，基因编辑可以治疗更广泛的遗传疾病，包括常染色体显性遗传病、因基因产物过少或过多而引起的疾病，或其他简单的基因过度表达无法最佳挽救疾病的疾病。即使对于可以通过现有基因增强或基因沉默策略解决的疾病，通过安装突变来增加或减少靶基因表达的基因编辑疗法也可以通过一次性治疗达到相同的效果，从而提供永久治愈的可能性。更广泛地说，即使没有致病突变的个体，患某些主要疾病（如冠心病）的风险也可以通过精确修改靶基因来调节，这使得基因编辑（如果被证明足够安全有效）有朝一日可能用于降低普通人群的疾病风险。治疗性基因编辑的前景促使人们做出巨大努力将基因编辑疗法引入临床。最近的进展包括开发用于哺乳动物细胞基因编辑的强大工具，包括可编程核酸酶、碱基编辑器和引发编辑器（Anzalone 等人，2020 年；Doudna，2020 年；Newby 和 Liu，2021 年）。这些基因编辑剂具有
在天然形成的口腔中对淀粉样蛋白的离体检测...
摘要。背景：口腔感染与阿尔茨海默氏病的病因有关。目的：检测微生物生物膜内的淀粉样蛋白（a）。方法：将牙周疾病的新鲜牙齿（n = 87）分为A组（n = 11），原发根管感染和B组（n = 21）（n = 21），牙髓牙齿治疗失败，通过Gutta Percha root -Finfinfinfinforling识别。生物膜特征。用抗A抗体免疫抑制了脱矿质的蜡嵌入牙齿切片和矿化的微积分生物膜。使用抗A抗体或在阿拉德岩树脂中处理用于超微结构的丙烯酸树脂组织免疫机染色（IGS）的分类丙烯酸树脂组织免疫机胶染色（IGS）。结果：SEM证明了含有细胞外聚合物物质（EPS）和水通道的多生物生物膜的原位演示和gutta植物。对A组的脱水蜡切片的补液进行了免疫组织化学，表现出对外部（微积分和斑块）和所有受感染区域的染色。在B组中，Gutta Percha Biofimfm Igss给出了a的确定结果。 具有感染的核内（A组）和20％的Gutta Percha Bioflm（B组）EPS EPS的透射电子显微镜含有可变大小的电子致密的纤维，其中一些是人类A纤维的典型。在B组中，Gutta Percha Biofimfm Igss给出了a的确定结果。具有感染的核内（A组）和20％的Gutta Percha Bioflm（B组）EPS EPS的透射电子显微镜含有可变大小的电子致密的纤维，其中一些是人类A纤维的典型。结论：这项研究检测到牙周和牙髓和牙髓自然生物膜的EPS中可溶性和不溶性A纤维，这强烈表明其作为抗菌肽在对抗局部感染中的作用，并具有潜在的风险，可在大脑中进行交叉播种。
通过体内超成名的氨基酰基-TRNA合成酶的定向演变
抽象的遗传密码扩展（GCE）已通过实现非经典氨基酸（NCAA）的位点掺入到蛋白质中，已成为生物学的关键工具。GCE的中心是正交氨基酰基-TRNA合成酶（AARS）/tRNA对的开发，其中工程的AARS识别所选的NCAA并将其充电到解码空白密码子的TRNA（例如，琥珀终止密码子）。许多正交的AARS/tRNA对涵盖了广泛的NCAA，这是通过定向进化产生的，但是标准策略通过标准策略的新AARS/TRNA对的演变仍然是一个劳动密集型的过程，通常会产生AARS/TRNA对，并产生副最好的NCAA NCAA INCAA Incorpiesies。在这项研究中，我们提出了一种发展AARS的策略，该策略利用Orthorep来推动其在酵母中的连续超女。我们在8个独立的AARS进化运动中展示了我们的战略，从4个不同的AARS/tRNA父母开始，针对7个不同的NCAA。我们观察到了多种新型AARS的快速演变，能够将13个NCAA的整体范围纳入响应于琥珀色密码子的蛋白质中。一些进化的系统达到了琥珀色密码子指定的NCAA依赖性翻译的效率，可与酵母中有义务密码子指定的天然氨基酸翻译相当。此外，我们发现了一个令人惊讶的AAR，它演变为自我调节自己的表达，以更大程度地依赖NCAA进行翻译。这些发现证明了由Orthorep驱动的AARS进化平台支持GCE技术持续增长的潜力。
在体内没有糖尿病作用的功能性牛轧糖的发展
牛轧糖是一种由鲜奶，糖，蜂蜜和坚果制成的糖果食品。在传统的意大利牛轧糖食谱中，混合物用香草提取物调味，并用烤杏仁包装。由于大量糖，传统的牛轧糖被禁止使用糖尿病患者的饮食。在目前的工作中，我们旨在开发创新的无糖牛轧糖，并将其纹理和感觉性能与商业牛轧糖的质地和感觉属性进行比较。最后，我们测试了非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的残留高血糖效应，这是一种1型糖尿病模型。，我们使用传统的工业仪器将黄原胶，红th素和蛋白与蛋清和杏仁混合，开发了一种无糖的牛轧糖配方。技术分析表明，就剪切力而言，该结构与传统耐嚼牛轧糖的结构相当。感觉分析表明，保留了风味和甜度，而凝聚力和可断裂性发生了显着变化。有趣的是，创新的食物组成对另外两个纹理参数产生了积极影响。溶解度和粘合性。体内实验表明，没有患有糖尿病的实验性牛轧糖的组中的小鼠数量明显高于用商业牛轧糖喂养的小鼠（66.6％vs。33.0％； p <0.05），与没有牛轧糖的小组没有什么不同（72.7％; p = 0.37）。 总而言之，与传统产品相比，我们以试点量表生产具有创新的无糖牛轧糖，具有改进的质地和类似的感觉特性。33.0％； p <0.05），与没有牛轧糖的小组没有什么不同（72.7％; p = 0.37）。总而言之，与传统产品相比，我们以试点量表生产具有创新的无糖牛轧糖，具有改进的质地和类似的感觉特性。体内，实验性牛轧糖没有显着增加糖尿病的发病率。
使用药物盒在体内淘汰基因
“基因敲除”或“敲除”是一种使基因功能失活的突变。这些突变对于经典的遗传研究以及包括功能基因组学在内的现代技术非常有用。过去，细菌基因的敲除通常是通过转座子诱变做出的。在这种情况下，需要费力的屏幕才能找到感兴趣的基因的淘汰赛。传统上，首先使用体外基因工程来修改质粒或细菌性人工染色体（BAC）的基因，然后将这些修饰的构建体移至细胞培养技术感兴趣的生物。利用基因工程和体内同源重组的组合的其他方法充其量效率低下。重新组合提供了一种直接在细菌染色体上产生基因敲除突变的新方法，或者将体内任何质粒或BAC修改为在其他生物体中敲除的前奏。构造设计为基础对，
基于体内标签和细胞跟踪的新视觉
摘要：尽管有有关心脏病的不同遗传，表观遗传和分子特征的广泛信息，但先天性心脏缺陷的起源仍然未知。大多数遗传学和分子研究是在胚胎心脏进行性解剖学和组织学变化的背景下进行的，这是对先天性心脏病起源有限了解的原因之一。我们整合了有关人类胚胎的描述性研究的发现，以及对雏鸡，大鼠和小鼠胚胎的实验研究。这项研究基于心脏发展的新动态概念和两个心脏场的存在。第一个场地对应于直式心管，从第二个心脏场中的中胚层细胞逐渐募集到其中。总体目的是为心脏和大动脉的先天性缺陷的分析，诊断和区域化分类创造新的愿景。除了强调遗传因素在先天性心脏病的发展中的重要性外，本研究还提供了有关直心管的组成，扭曲和折叠的过程以及右心室的发展的命运的新见解。基于体内标记和细胞跟踪的新视力，并通过诸如胃类和器官等模型增强，这有助于更好地理解心脏形态发生的重要误差，这可能导致几种先天性心脏病。